摘　要：食源性致病菌污染是乳制品安全问题的重要隐患之一，乳品中常见的食源性致病菌有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌等。目前，乳品中致病菌的检测以培养法为主，但此类方法操作较为繁琐，且耗时长，不能满足检测的时效需求。本文探索了荧光定量PCR技术在快速检测乳品中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的应用，并进行了大量的验证试验和实际检测，形成了乳品中致病菌快速检测的新体系。该体系可以在24h内完成金黄色葡萄菌和沙门氏菌的增菌与检测，缩短了整体检测时间，降低了检测成本，为进一步改良乳品中致病菌快速检测提供了参考数据。
关键词：乳品　金黄色葡萄菌　沙门氏菌　荧光定量PCR 检测

    在食品安全问题日益多元化的今天，在食品中占特殊地位的乳及乳制品的安全性一直是社会和科学研究关注的焦点。乳制品营养丰富、搭配均衡，是一种经济实惠的优质蛋白。我国是乳制品消费大国，也是世界第三大乳制品生产国。国家统计局数据显示，^[1]我国城镇居民家庭鲜奶人均购买量由1996年的4.6kg上升到2006年的18.3kg，虽从2007年开始有所下降，但一直维持在14kg左右。然而，近年来频繁发生的乳与乳制品质量安全事件引起了人们对乳制品安全的普遍关注。乳品极易遭受致病菌污染，常见的污染乳制品的食源性致病菌有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌等，其进入人体后会造成腹泻、呕吐、急性肠胃炎等病症，严重时会危及生命。其中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌是乳品检测最普遍的项目。
    金黄色葡萄球菌肠毒素是世界性卫生问题，乳品尤其是原料乳极易受到金黄色葡萄球菌的污染。2009年欧洲食品安全局报道了5550例食物中毒事件，导致49000人患病、46人死亡，其中293例由金黄色葡萄球菌感染引起，由此可见金黄色葡萄球菌的危害极大。是欧洲最常见的4种引发食物中毒的病原菌之一^[2]，生乳及乳制品污染中比较常见的另一种食源性致病菌是沙门氏菌(Salmonella spp.)，受其感染的人和动物会出现伤寒、副伤寒等病症，沙门氏菌一旦进入血液组织，则会导致系统性炎症，甚至死亡。1994年美国暴发了由沙门氏菌导致的冰淇淋污染，导致约22400人患病^[3]。
    一个中等规模的乳品工厂，一天生产的不同类产品至少有上百个批次，加工过程中的原料、过程品、终产品、生产环境都需要检测金黄色葡萄球菌和沙门氏菌。GB 4789.1-2016规定同一批次产品需采集5个样品进行检测，故工厂的检测量每天高达几百个。根据GB 4789.4-2016和GB 4789.10-2016，沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的定性判定至少需要3d，该方法操作较繁琐、耗时长，不能满足检测的时效需求。由于低温奶保质期较短，我国正在推动的国家优质乳工程，在对产品要求提高的同时也对检测技术提出了新的挑战。
    本文提出的创新检测体系优化了样品前处理过程，并引入了荧光定量PCR分子检测技术，可以在24h内完成金黄色葡萄菌和沙门氏菌的增菌和检测。在进行了大量验证试验和实际检测后，结果表明此检测体系稳定性好，准确性高，缩短了整体检测时间，并降低了检测成本，为乳品致病菌检测技术的创新发展提供了研究基础。
1 实验思路
    常见致病菌qPCR的检测限一般在10³CFU/mL以下^[4~6]，而增菌后浓度一般可达10⁵CFU/mL以上，增菌后多个样本增菌液混合提取核酸处理检测相当于稀释多倍（5个样本增菌液混合相当于稀释5倍），一般会高于检测限，从理论上来讲，采用五合一PCR检测能够满足国标方法检测的需求。
2 实验材料
    2.1 样本
    样品取自光明乳业华东中心工厂生产线，主要为发酵乳（包括风味发酵乳、果味发酵乳、畅优发酵乳、健能发酵乳、大果粒发酵乳和莫斯利安发酵乳）和部分鲜奶制品（包括无乳糖牛奶、优倍牛奶、纯牛奶与致优全鲜乳）。
    2.2 菌株
    金黄色葡萄球菌阳性菌株：ATCC27217；沙门氏菌阳性菌株：CMCC50333。
    2.3 主要试剂
    金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒（PCR-探针法）LR70501、沙门氏菌核酸检测试剂盒（PCR-探针法）LR70601，购自北京良润生物科技有限公司。
    2.4 主要仪器
    实时荧光PCR仪：雅睿MA-6000P；恒温培养箱、离心机（2mL、5mL、7mL）、掌式离心机（0.2mL 8联管）、金属浴、涡旋混合器、移液器（10μL、100μL、1000μL）及吸头、离心管（2mL、5mL、7mL）、PCR反应管（0.2mL）等。
3 实验方法
    3.1 验证实验
    同一样品的5次采样为1组，其中取1~5次进行金黄色葡萄球菌/沙门氏菌添加（10¹ CFU），使用国标增菌培养基增菌后，分别取1mL混合后进行基因组提取，5次采样的增菌培养基按照国标方法继续进行后续鉴定，并记录鉴定结果（共30组，只记录组检测结果）。
    3.2 样本实验
    在工厂进行实际样本（发酵乳及部分其他鲜奶制品）的检测，采用五合一PCR方法（同时以国标方法来做对比）记录每组检测结果，共1596组发酵乳、912组鲜奶制品。在前两周的检测中，每天从样品中取两组，从中各取一份样品进行阳性添加并记录检测结果（共30组）。
4 结果与分析
    4.1 验证结果分析
    金黄色葡萄球菌五合一PCR验证实验结果表明，五合一PCR检测与普通国标法检测结果没有显著性差异，不会出现漏检现象，如表1。
表1 金黄色葡萄球菌五合一PCR验证

阳性添加n/5*1	样本数量	国标法阳性*2	PCR阳性*3
1/5	6	6	6
2/5	6	6	6
3/5	6	6	6
4/5	6	6	6
5/5	6	6	6

 
注：*1表示该样品的5次采样中取n次做阳性添加；*2表示1个样品的5次采样按照国标法检测，有一次为阳性该样品即为阳性；*3表示1个样品的5次采样增菌后各取1mL混匀后进行基因组提取检测，结果即为样品结果。
 
    沙门氏菌五合一PCR验证实验结果表明，该检测与普通国标法检测结果没有显著性差异，不会出现漏检现象，如表2。　　　
表2 沙门氏菌五合一PCR验证

阳性添加n/5*1	样本数量	国标法阳性*2	PCR阳性*3
1/5	6	6	6
2/5	6	6	6
3/5	6	6	6
4/5	6	6	6
5/5	6	6	6

 
注：*1表示该样品的5次采样中取n次做阳性添加；*2表示1个样品的5次采样按照国标法检测，有一次为阳性该样品即为阳性；*3表示1个样品的5次采样增菌后各取1mL混匀后进行基因组提取检测，结果即为样品结果。
    4.2 样本实验结果分析
    在1596组发酵乳及912组鲜奶制品的金黄色葡萄球菌检测实验中，五合一PCR检测与国标法检测结果没有显著性差异（国标法发酵乳金黄色葡萄球菌检测有55组疑似阳性，但后续验证结果为金黄色葡萄球菌阴性；共30组样品的阳性添加用两种方法检测都为阳性），如表3所示。     在1596组发酵乳及912组鲜奶制品的沙门氏菌检测实验中，五合一PCR检测与国标法检测结果没有显著性差异（国标法沙门氏菌检测有38组疑似阳性，但后续验证结果为沙门氏菌阴性；共30组样品的阳性添加用两种方法检测都为阳性），如表4所示。 5 结论与展望
    5.1 结论
    本文探索了一种乳品中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌快速检测体系，采用Real-Time PCR方法，对一组样本5次采样的前增菌液混合后进行基因组提取，使用金黄色葡萄球菌和沙门氏菌核酸检测试剂盒进行检测，极大的缩短了检测时间，减小了工作强度。
    经过验证实验以及实际样品加标实验，五合一PCR检测与常规国标检测结果并没有显著差异，不会造成漏检。
通过对1596组发酵乳及912组鲜奶制品的应用实验，在检测发酵乳与鲜奶制品时，五合一PCR检测与常规国标检测相比耗时更少，准确度更好，工作强度更低。
    5.2 展望
    目前，有研究人员探索了食品中多种致病菌的同步增菌^[7]技术，未来有希望由一种培养基来实现多种致病菌的同步增菌，而多重PCR也可实现多种致病菌的同时检测，技术的发展将会使致病菌的检测更加便捷。
    近年来，国际标准化组织（ISO）已将PCR方法制定为检测食源性致病菌的标准化方法^[8]。不久的将来，荧光定量PCR有望在沙门氏菌及其他致病菌快速检测上实现方法的标准化。建议食品检验方法应剥离于安全标准之外（即非强制性），给予检测者选择使用快速检验方法的合理空间。
    随着乳制品质量要求和营养要求的不断提高，对相应的检测技术也提出了更高的要求。随着科技的不断发展，乳制品中致病菌的检测灵敏度、特异性、准确性、便捷性和及时性等方面都将得到不断的发展和改善。
参考文献：
    [1] 张亚红，王娉.预测微生物学在乳及乳制品中的应用[J].检验检疫学刊，2015，25(6):62-65.
    [2] European Food Safety Authority.The European Union summary report on trends and sources of Zoonoses,Zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2009[J].EFSA Journal，2011，9(3):2090.
    [3] 鄢雷娜等.乳制品中常见食源性致病菌检测技术的研究进展[J].食品安全质量检测学报，2017，8(1):137-141.
    [4] 佘容等.TaqMan荧光定量PCR在饲料沙门氏菌检测中的应用评估[J].中国预防兽医学报，2015，37(12).
    [5] 苏裕心等.荧光定量PCR快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立[J].军事医学科学院院刊，2010，34(1).
    [6] 张驰等.食品中3种致病菌的Taqman多重荧光定量PCR检测[J].食品研究与开发，2011，32(4).
    [7] 张巧艳等.乳制品常见致病菌选择性共增菌技术研究[J].中国乳品工业，2011，39(5).
    [8] Malorny B,Made D,Teufel P,et al. Multicenter validation study of two blockcycler-and one capillary-based real-time PCR methods for the detection of Salmonella in milk powder[J]. International Journal of Food Microbiology，2007，117:211-218.