近日，国内某肉鸡生产企业爆出非法使用某些饲料添加剂事件，在肉鸡饲养中非法添加多种兽用药物。众所周知，目前抗生素滥用状况比较突出。而且食源性抗生素几乎百分之百来自于动物源性食品的摄入，如被曝光的利巴韦林和金刚烷。

　　目前，相关部门尚未发行针对利巴韦林和金刚烷胺在动物源食品中的检测技术方法和国家标准，所以在媒体报道鸡肉中检测出利巴韦林和金刚烷成分后，AB SCIEX公司亚太应用支持中心上海实验室迅速开发了以畜产品为基质的样品中利巴韦林和金刚烷的检测方法。公司在最短的时间内开发出快速、准确、灵敏、高效的检测方法，并开设多场技术讲座，为用户提供详细的技术讲解和应用培训。除此之外，还为用户提供β-内酰胺类，大环内酯类，磺胺类，四环素等多种抗生素的检测方法，为客户提供全套的技术支持。

　　实验内容

　　1.仪器设备和试剂

　　AB SCIEX公司5500 QTRAP系统配岛津UFLC液相，安捷伦公司Poroshell 120EC-C18，2.1mmx150mm，2.7μm色谱柱。

　　利巴韦林标准物质（纯品）、金刚烷标准物质（纯品）、乙腈（色谱纯）、三氯乙酸（分析纯）、去离子水（Millipor超纯水，电阻≥18.2M?ocm）。

　　2.色谱条件

　　流动相A：含0.1%甲酸水溶液（含5mM甲酸铵），流动相B：乙腈/水（v/v，95:5）溶液，流速、梯度洗脱见表1；

　　柱温：40℃；

　　进样量：10μL。

　　3.质谱条件

　　（1）离子源参数

　　电离模式为ESI+；碰撞气CAD设置6（Medium）；气帘气Curtain Gas设置30Psi；雾化气Gas1/Gas2设置60/60Psi；喷雾电压IS设置5500V；离子源温度TEM设置650℃。

　　（2）化合物参数

　　化合物质谱参数见表2。

　　4.标准溶液的配制

　　两种标准物质用乙腈稀释到1000mg/mL的标准储备液，将利巴韦林稀释为到0.2、0.5、1、2、5、10ng/mL，金刚烷稀释到0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10ng/mL的混合标准工作浓度。

　　5.样品制备

　　准确称取肌肉剪碎均质样品（2g±0.02）g于10mL具塞离心管中，加入2mL提取液（乙腈∶1%三氯乙酸溶液为7∶3），旋上盖后涡旋2min，室温下超声20min，5000r/min离心10min，吸取上清液于10mL离心管中；取残渣中再加入2mL提取液，同法操作，合并两次上清液；将上清液混合均匀后，经0.22μm过滤器过滤后，待仪器测定。

　　结果与讨论

　　1.方法前处理

　　实验中利用乙腈/1%三氯乙酸溶液提取液提取肌肉组织中利巴韦林和金刚烷，提取后无须经固相萃取或其他前处理步骤，这样大大简化了工作流程，提高了检测通量，并且无须担心由于人员水平或能力导致前处理回收率产生误差。简单的前处理过程，对质谱的抗污染能力是一种极大挑战，要求仪器包括离子源、接口等关键部件的超强抗污染能力。

　　AB SCIEX公司Turbo VTM离子源及Interface接口的超强抗污染能力、强耐用性以及易维护等优势，允许未经净化提纯处理样品进入质谱，并且不损失灵敏度。经实验证实，该前处理方法简单、可行、准确度高，适合实验室日常检验工作需要。

　　2.样品色谱峰

　　根据利巴韦林的结构推断其极性很强，在C18上的保留较差，所以液相初始条件中有机相比例要求非常低，但是常见C18色谱柱若使用纯水溶液为流动相易导致疏水塌陷的问题，降低色谱柱的使用寿命。所以实验时需要恰当选择色谱柱以及色谱条件，实现利巴韦林和金刚烷的同时检测。

　　图1中展示了利巴韦林和金刚烷含量为1ng/mL时的色谱图，图中在4.25min存在干扰峰，这可能是由于实验过程中未经提纯步骤导致的，但是对利巴韦林和金刚烷化合物的定量并不存在干扰。

　　3.仪器灵敏度

　　取空白基质样品，通过标准溶液添加的方式，按照上述操作处理样品，逐级降低浓度，直至仪器不能检出，确定方法的最低检出限（LLOD）及最低定量限（LLOQ）。当利巴韦林含量降低至0.1ng/mL时信噪比（S/N）为3.3，定为方法的检出下限。0.01ng/mL金刚烷胺含量降低至0.01ng/mL时信噪比（S/N）为3.2，定为方法的检出下限。同理，S/N≥10为定量下限的原则，确定利巴韦林的LLOQ为0.2ng/mL、金刚烷为0.05ng/mL。

　　4.方法线性及重现性

　　（1）方法线性

　　取鸡肉空白基质，按照上述操作处理样品，稀释利巴韦林到0.2、0.5、1、2、5、10ng/mL，金刚烷稀释到0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10ng/mL的混合标准工作浓度，经采集数据绘制标准曲线。得到利巴韦林的标准回归方程y1=4645.76x1+5.81，此时的线性相关系数R1=0.9993；金刚烷的标准回归方程y2=13229.71x2+132.45，此时的线性相关系数R2=0.9997。

　　（2）结果重现性

　　通常化合物高浓度下的重现性均明显好于低浓度时的重现性，但是低浓度的重现性明显是实验室需要关注的，所以设计实验室考察方法LLOQ时的重现性。取鸡肉空白基质，按照上述操作处理样品，通过添加标准溶液考察方法重现性。通过添加0.2ng/mL的利巴韦林和0.05ng/mL的金刚烷标准溶液，每个样品制备重复2次，采集重复3次（n=6），利用两种化合物定量离子数据算方法重现性。结果发现在该浓度下，利巴韦林相对标准偏差3.56%，金刚烷相对标准偏差4.22%。

　　结 论

　　AB SCIEX公司一直致力于为用户提供全方位的解决方案，在"速生鸡"曝光事件发生后，迅速组织专业人员建立相关检测方法，在第一时间为用户提供LC/MS测定畜产品中利巴韦林和金刚烷的整体解决方案。方法的整个分析过程具有通量高、重现性好、稳定性强以及对实验人员要求不高等优点，并且适用于AB SCIEX公司各种检测系统。

　　来源：食安中国
来源：食安中国