短杆菌肽是由芽孢杆菌产生的一种常见和已被良好表征的跨膜肽物质，被用作对抗革兰氏阳性和某些革兰氏阴性细菌的局部用抗生素。用反相液相色谱（RPLC）分析疏水性肽和蛋白质难度很大。因为溶液中经常需要使用洗涤剂保持疏水性物质的稳定性，而这些洗涤剂容易发生聚集或沉淀，严重影响它们的回收，这些因素及其他原因使得难以用RPLC分离疏水性肽和蛋白质。在ACQUITY UPC2 TM系统上使用沃特世（Waters?）超高效合相色谱技术分离典型跨膜肽-短杆菌肽的方法，可得到线性和可重复的结果，测定的OTC制剂浓度为标示量的98.4%，是准确、高精度分析短杆菌肽的方法。

　　沃特世解决方案：ACQUITY UPC2系统；ACQUITY? SQD;ACQUITY UPC2 CSH氟苯基色谱柱；EmpowerTM 3软件。

　　实 验

　　除非另有说明，以下是用于所有色谱最终方法的最佳条件。

　　1.UPC2测试条件

　　UPC2系统： ACQUITY UPC2；检测器：PDA、ACQUITY SQD PDA@280nm,分辨率为6nm（补偿400～500nm）；色谱柱：ACQUITY UPC2 CSH氟苯基，3.0mmx100mm,1.7μm；柱温：50°C；样品温度：15°C；UPC2 ABPR: 1885psi；进样量：1μL；流速：2.0mL/min；流动相A：CO2；流动相B：含0.1%TFA的甲醇（除非另有标示）；梯度：20%～30%B，1.5min。

　　2.SQD条件

　　离子源：ES+；锥孔电压：20V；毛细管电压：3.7kV；源温度：150°C；脱溶剂气温度：500°C；脱溶剂气体流速：400L/hr；锥孔气体流速：25L/hr；SIR: 922.6,930.3,941.9。

　　3.数据管理

　　Empower 3软件。

　　4.样品描述

　　用解硫胺素芽孢杆菌（短芽孢杆菌）制备的短杆菌肽从Sigma Aldrich公司购买，将样品溶解在甲醇中制成0.5mg/mL浓度的溶液，如需要，可用甲醇稀释。含有短杆菌肽的非处方软膏是从当地药店购买的。将0.2g软膏溶解在10mL正己烷中，然后用5mL甲醇萃取短杆菌肽，去除甲醇层，用0.2μm的烧结玻璃盘过滤，然后直接进样ACQUITY UPC2系统。

　　结果与讨论

　　我们系统性地筛选了４种色谱柱，测定哪种分离效果最佳，结果如图1所示，色谱柱筛选过程可在1小时内非常快速地完成。在我们设定的筛选条件下，BEH 2-EP和BEH色谱柱未检测到谱峰，由于其他色谱柱表现出合适的色谱性能，因而未对这两者的非洗脱原因深入研究，其中ACQUITY UPC2 CSH氟苯基色谱柱检测的色谱峰形最佳，因此采用该色谱柱继续研究。

　　


      图１中所有色谱柱规格为3.0mmx100mm，填装亚-2-微米填料；所有分离条件都采用流动相A：CO2；流动相B：含0.1%FA的MeOH，（2mL/min, 3%B～25%B，5min）。

　　为了分离短杆菌肽物质，对酸性改性剂的影响进行了研究，结果表明使用三氟乙酸（TFA）可得到稍好的峰形，提高了短杆菌肽A和短杆菌肽C之间的分离度。对于要求更高灵敏度的应用，可能需要降低TFA浓度或使用甲酸，以达到希望的检测限值。

　　当设置好合适色谱条件后，通过减少梯度时间优化分离过程，结果如图2所示，能够在1.5min时间内使每种短杆菌肽组分的分离度达到1.4或更高，在相同流速下通过减少运行时间增加梯度斜率，不但实现有效分离，同时还将短杆菌肽A的信噪比从336提高至605。

　　我们测试了最佳分离条件，能够使用单四极杆质谱（SQD）检测每种物质，图3显示每种物质都被质谱良好分离和检测到，另外每种短杆菌肽物质都显示含有绝大多数的M+2H离子，后续的研究将使用这些参数进行选择离子监测。

　　为了评估我们的方法是否适用于定量分析市场上销售的非处方药中的短杆菌肽，我们在ACQUITY SQD上使用选择离子监测，结果如图4A所示。我们绘制浓度-峰面积曲线，得到每种物质的校正曲线。结果发现，如图4B～D所示，每种成分在测试范围内都呈线性响应。另外还使用校正曲线测定了非处方药物中的每种短杆菌肽物质浓度。

　　使用开发的方法评估非处方药物中的短杆菌肽物质的浓度和相对丰度。如图5所示，重复分析结果表明：每种短杆菌肽%RSD值小，计算浓度与标签上的标称值相吻合；我们还发现短杆菌肽物质的相对丰度与文献报道的丰度非常吻合。

　　结 论

　　ACQUITY UPC2系统与ACQUITYUPC2色谱柱化学结合使用，可为短杆菌肽提供简单、准确和可重现的分析方法。该工作表明ACQUITY UPC2系统可用于分析疏水性肽，还可能用于分析疏水性蛋白质，例如膜蛋白。
来源：食安中国