随着我国经济的快速发展，从产气荚膜梭菌检验工作的实际情况来看，现有标准与出现的新情况、新问题不相适应，主要表现在：原标准的适用性、内容的完整性、操作的规范性等方面还有待进一步的提高。中国检验检疫科学研究院、中国疾病预防控中心营养与食品安全所和辽宁出入境检验检疫局适时地组织和开展对GB/T 4789.13-2003《食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》的修订，修订后的标准已经颁布实施了。

　　产气荚膜梭菌（Clostridium Perfringens）是引起食源性胃肠炎最常见的病原菌之一，该菌的各种检测方法对保障食品安全起着非常重要的作用，尤其是食品安全国家标准。现就GB 4789.13－2012《食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》主要修订的部分进行说明，包括以下5个方面。

　　1 样品制备

　　如样品采集后不能立即进行检验，以前不知道样品该如何处理，现在就可以依据GB 4789.13－2012《食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》中5.1样品制备部分对样品及时进行正确处理。另外，针对固体或半固体样品的处理，增加了拍击式均质器均质的方法，该方法处理样品时效率高且效果好。拍击式均质器在微生物检测领域中已得到广泛应用，在国内外许多标准和方法中被推荐使用，及时增加该方法，使用时就有据可依了。

　　2 将选择性计数琼脂由亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）改为胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂

　　GB/T 4789.13-2003《食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》采用SPS 琼脂对产气荚膜梭菌进行计数，而US-FDA BAM（US-FDA Bacteriological Analytical Manual Chapter 16 Clostridium Perfringens（2001））、ISO标准（ISO 7937 Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the enumeration of Clostridium perfringens-Colony-count technique）和AOAC官方方法[AOAC Official Method 976.30：Clostridium Perfringens in Foods Microbiological Method（First Action 1976；Final Action 1979）]均采用TSC琼脂对产气荚膜梭菌进行计数，所以安排试验比较TSC琼脂与SPS琼脂的效果。将国内外4个不同品牌的TSC琼脂与SPS琼脂进行了标准菌株的回收率测定实验，比较不同培养基对产气荚膜梭菌的灵敏度和特异性。

　　产气荚膜梭菌ATCC13124和NCTC8237、双酶梭菌ATCC638、艰难梭菌ATCC43593及产芽孢梭菌ATCC11437用液体硫乙醇酸盐培养基（北京陆桥技术有限责任公司提供）进行活化，36±1℃培养24h，分别吸取1mL上述标准菌株的新鲜培养物，加入含9 mL0.1%蛋白胨水（北京陆桥技术有限责任公司提供）的试管中，振摇试管使其混合均匀，制成1∶10的稀释液。按上述操作，依次制成一系列10倍梯度的均匀稀释液。选取10-5和10-6稀释度，分别移取1mL于各个平皿，倾注培养基进行计数，待凝固后，倾注一层培养基，琼脂凝固后，正置于36±1℃厌氧培养24h，以厌氧琼脂为对照计算回收率。

　　实验结果见表1，产气荚膜梭菌在TSC琼脂平板上呈黑色菌落，见图1。结果表明，国内外培养基差异不大，TSC琼脂的回收率明显大于SPS琼脂。
 

　　3 活菌计数培养中修改了接种方法及培养条件

　　涂布接种方法一般取0.1mL样品匀液进行接种，接种量较小，误差对计数结果的影响相对较大，所以采用了倾注计数法，其接种量为1mL。但与GB/T 4789.13-2003《食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》不同的是，TSC琼脂凝固后，增加了"用10mL TSC琼脂覆盖平板表层"，并将"倒置培养"改为"正置培养"。这样修改后更有利于产气荚膜梭菌的生长，同时有助于获得黑色菌落的典型形态，还可有效防止菌落蔓延生长。产气荚膜梭菌为厌氧菌，如果在TSC琼脂平板表面接种，培养后菌落一般为灰色或无色菌落，不容易得到黑色的典型菌落。
 

　　4 确证实验中将卵磷脂分解试验改为乳糖-明胶试验

　　发酵乳糖和液化明胶是产气荚膜梭菌的两项重要生物学特性，ISO标准和AOAC官方方法中，均使用"乳糖-明胶试验"和"动力-硝酸盐试验"两组生化试验来进行产气荚膜梭菌的确证，说明"乳糖-明胶试验"的重要性。US-FDA BAM中指出，一些巴氏梭菌（C.baratii）也能使含铁牛乳培养基呈"暴烈发酵"现象，但这些菌乳糖发酵阴性且能使明胶液化，因此可以通过乳糖-明胶试验加以区分。US-FDA BAM和AOAC官方方法中均指明少数产气荚膜梭菌菌株的卵磷脂酶较弱或阴性，所以"卵磷脂试验"容易造成假阴性。最终通过多株标准菌株和样品添加试验说明了乳糖-明胶试验替代卵磷脂分解试验是非常必要的。

　　5 菌落计数中增加了典型菌落计数原则和计算公式

　　5.1选择计数平板的范围由30～300CFU修改为20～200CFU，与US-FDA BAM和AOAC官方方法一致。另外，ISO 7937中计数范围为<150CFU，也远小于GB/T4789.13-2003《食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》中规定的范围。主要原因是产气荚膜梭菌在平板上生长的菌落较大，缩小计数范围可使计数结果更准确，更具统计学意义。

　　5.2典型菌落计数原则参考了GB 4789.10-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》中的8.4.2。

　　5.3计算公式则是参考了GB4789.10-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》和GB4789.2-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》两个标准中的计算公式。由于产气荚膜梭菌是采用倾注法培养，接种量为1mL，每个稀释度需要做两个平行测定，而且要从典型菌落中挑取10个菌落（不足10个全选）进行确证实验，所以本标准同时参考了以上两个已颁布的标准，设定了产气荚膜梭菌计数适宜的计算公式。

　　以上是GB 4789.13－2012《食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》主要修订的5个方面，有助于对该标准的准确理解。

　　参考文献

　　[1] US-FDA Bacteriological Analytical Manual Chapter 16 Clostridium Perfringens（2001）。

　　[2] ISO 7937 Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the enumeration of Clostridium perfringens-Colony-count technique.

　　[3] AOAC Official Method 976.30：Clostridium Perfringens in Foods Microbiological Method（First Action 1976；Final Action 1979）。

　　[4] SN 0177-92 中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌检验方法。

　　[5]  GB/T 4789.13-2003中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验。
来源：食安中国