□ 何瑛 林木娣 赖书莹 刘传栩 梁俊健 广东燕塘乳业股份有限公司检测中心

　　摘 要：本文建立了使用紫外分光光度计测定原料乳及乳制品中硫氰酸钠含量的方法，方法利用硫氰酸钠与硝酸铁反应产物硫氰酸铁的光度值间接测定硫氰酸钠的含量。结果显示，吸光度与硫氰酸钠质量浓度线性关系、检出限实验、重复性实验、回收率实验等方法学实验均效果良好，测得结果与离子色谱法结果没有显著性差异，提示方法可行，适于乳品企业对硫氰酸钠的快速检测。

　　关键词：硫氰酸钠 紫外分光光度法 硝酸铁 乳及乳制品硫氰酸钠(NaSCN)是生乳中天然存在的一种活性抗菌体系，其乳过氧化物酶体系(LPS)可以抑菌保鲜。1991年，WHO和FAO的食品法典委员会公布的CAC/GL 13-1991《乳过氧化物酶体系用于原料乳的保鲜指南》中，硫氰酸钠作为LPS的活化剂[1]被允许添加到牛奶中;我国也于随后颁布标准，允许将其添加到无冷链运输体系中用于原料乳保鲜，添加量为15mg/L[2～3]。

　　但硫氰酸钠属有毒有害物质，其主要毒性作用为以抑制细胞色素氧化酶活性为主的急性毒性与以抑制碘转运及甲状腺素合成的慢性毒性，尤其对胎儿和婴儿的脑部与神经系统发育存在较大的危害[4]。随着社会对食品安全重视度提高及原奶冷链运输的完善，国家废除了之前的标准并于2008年12月公布《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单(第一批)》，规定乳及乳制品中硫氰酸钠属违法添加物质。

　　目前，我国尚未制定检测牛奶中硫氰酸钠的标准及限值。本文采用紫外分光光度法测定牛奶中硫氰酸钠含量，与离子色谱法相比，其操作简捷且结果准确，仪器易普及，适合在各乳品企业推广使用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　1.1.1 材料

　　生乳采自广东、福建、广西、天津等地的奶牛场;原料乳粉为新西兰进口奶粉;乳制品包括市售巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳、调制乳等。

　　1.1.2 试剂

　　1.1.2.1 三氯乙酸溶液(200g/L)：称取三氯乙酸200.0g，用纯水溶解并稀释至1000mL;

　　1.1.2.2 硝酸铁溶液(16g/L)：称取硝酸铁(Fe(NO3)3•9H2O)2.674g，用纯水溶解并稀释至100mL，加入2mL浓硝酸，避光保存;

　　1.1.2.3 硫氰酸钠标准储备液(1000mg/L)：将硫氰酸钠标准品(光谱纯，GR)置于80℃烘箱内干燥2h，准确称取干燥后的硫氰酸钠0.1000g于100mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，混匀后置于4℃避光保存;

　　1.1.2.4 硫氰酸钠标准工作液(100mg/L)：准确吸取1.00mL硫氰酸钠标准储备液到10mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，混匀后备用，该试剂应现配现用。除非另有说明，本实验中使用的均为分析纯试剂和GB/T 6682-2008中规定的一级水。

　　1.1.3 仪器设备

　　UV-1800紫外可见分光光度计，电子分析天平，离心机，电热恒温鼓风干燥箱，涡旋振荡器，移液枪。

　　1.2 方法建立

　　1.2.1 实验原理

　　牛奶中加入三氯乙酸(TCA)除去蛋白质和脂肪，过滤后取上清液加入高铁化合物，利用硫氰酸根与三价铁离子在pH值为1.0～1.5的条件下反应生成血红色的硫氰酸铁络合物[5]，在最大吸收波长处测定吸光度值，根据吸光度标准曲线确定其中硫氰酸钠的含量。

　　1.2.2 样品处理

　　(1)生乳或液态乳制品：吸取15mL样品于50mL的离心管中，边振摇边加入三氯乙酸溶液(1.1.2.1)10mL，充分混匀后静置15～30min，然后将样品离心(9000rad/min，3min)分离，上清液经定性滤纸双层过滤、弃去初滤液后待测。(2)乳粉：称取10.0g奶粉于200mL烧杯中，用65～80℃温水1︰10进行溶解，冷却后吸取该溶液15mL于50mL离心管，同1.2.2.1处理。

　　1.2.3 样品测定

　　分别吸取4mL待测液于10mL比色管中，加入2mL硝酸铁溶液(1.1.2.2)，混匀，反应10min后在450nm波长处测定吸光度值，以三氯乙酸溶液加显色剂作为试剂空白调零。测得的反应液吸光值应减去样品滤液的本底吸光值，得到净吸光值,将净吸光值代入标准曲线计算出样品中硫氰酸钠的含量。

　　1.2.4 标准曲线的绘制

　　取10mL比色管7支，选择反应液净吸光度值与试剂空白最接近的样品滤液作底液，分别吸取0、20、40、80、160、320、640μL硫氰酸钠标准工作液(1.1.2.4)，用底液定容至4mL，配制成浓度为0、0.5、1、2、4、8、16mg/L的硫氰酸钠基质加标溶液，然后加入2mL硝酸铁溶液混匀后静置10min显色，以试剂空白调零，在450nm波长处测定吸光度值，将测得的吸光值减去底液吸光值后得到的净吸光值对硫氰酸钠质量浓度作图。

　　1.2.5 计算

　　样品中硫氰酸钠的含量按以下公式进行计算：

　　其中：C为样品中硫氰酸钠的含量，mg/L;C0为由标准曲线得出的待测滤液中硫氰酸钠的含量，mg/L;V1为取样量，mL;V2为样品最终体积，mL;f为稀释倍数，液态样品f=1，固态样品f=10。

　　2 分析与讨论

　　2.1 沉淀剂的加入量

　　实验分别加入不同量的三氯乙酸溶液对样品中的蛋白质进行沉淀、离心(9000rad/min，3min)和过滤，然后将滤液静置一段时间观察沉淀效果，结果见表1，最终选择样品与沉淀剂的比例为30︰20进行前处理。

　　2.2 检测波长的确定

　　取16mg/L的硫氰酸钠基质加标溶液，显色后在400～700nm可见光区进行光谱扫描(见图1)，在此区域内溶液于波长450nm处有1个最大吸收峰，此时样品的吸光度值最大，响应最灵敏，且该波长前后吸收曲线斜率较小，故选择450nm作为检测波长。

　　2.3 显色剂及反应时间的确定

　　硫氰酸钠能与Fe3+反应生成硫氰酸铁红色络合物。实验初期考虑使用FeCl3溶液作为显色剂，但其显色不稳定且本底颜色较深，影响结果的准确测定;而Fe(NO3)3溶液中加入少量的浓硝酸后可抑制Fe3+的水解，本底颜色浅，可作为显色剂使用，实验发现其用量对显色效果有明显影响。

　　由图2可以看出，取4mL 20mg/L硫氰酸钠基质加标溶液进行显色反应，反应液吸光值随Fe(NO3)3加入量的增大而增大，当加入量为2mL时，曲线斜率较大，之后趋于平缓。实验选定滤液与显色剂的用量为4︰2并进行显色稳定性实验，结果如表2所示。

　　由表2可得，随着反应时间的推移，至反应后1h内，不同浓度的硫氰酸钠基质加标溶液吸光值(OD值)变化不大，根据实际操作情况，本实验选定显色反应时间为10min。

　　2.4 标准曲线底液的选择

　　实验发现牛奶底液成分对测定结果的影响较大，分别用纯水、三氯乙酸溶液、空白奶样(反应液净吸光度值与试剂空白最接近的样品，经离子色谱法测定未检出NaSCN)滤液作为底液配制标准曲线，测得的硫氰酸钠加标回收率如表3所示，最终选择空白奶样滤液作为本底构建标准曲线。

　　3 结果与验证

　　3.1 标准曲线的建立

　　按1.2.4的步骤进行实验，以硫氰酸钠基质加标溶液的浓度为横坐标，对应的净吸光度值为纵坐标，建立标准曲线如图3所示，得到回归方程y=0.021x+0.021，相关系数R2=0.9997。可见，硫氰酸钠浓度为0～16mg/L范围内，其质量浓度与吸光度线性关系良好。

　　3.2 检出限与回收率实验

　　按上述方法进行20次空白溶液测量，得到标准偏差S=0.0005，分别以3倍、10倍标准偏差除以工作曲线斜率计得方法最低检出限为0.07mg/L，最低定量限为0.25mg/L。

　　为验证曲线可靠性，任意选取一种奶样进行加标回收实验。分别吸取硫氰酸钠标准储备液0.015、0.03、0.06、0.18、0.30、1.20mL，加入液体奶样至60mL，充分混匀后吸取15mL按上述方法进行实验，每个标样平行测定3次，取平均值计算回收率，结果见表4。实验测得回收率在95.24%～101.19%之间，准确度较高。

　　3.3 重现性实验

　　任意选取生乳、原料乳粉、纯牛奶和调制乳样品各一个，按上述方法进行处理，平行测定6次，实验结果见表5。由表5可见，重复实验结果相对标准偏差在1.16%～2.38%之间，本方法对原料乳及乳制品中硫氰酸钠含量的测定重现性良好。

　　3.4 与离子色谱法的比较

　　取各类牛奶样品6个，分别用离子色谱法和紫外分光光度法测定硫氰酸钠含量，检测结果如表6所示。对两组数据作t检验，t=0.361

　　4 总结

　　实验测得各大牧场生乳样品中硫氰酸钠的含量在0.25～5mg/L之间，检出率较高但含量较低，可排除人为添加的可能，系属于奶牛防御体系天然存在的硫氰酸盐。本法具有操作简捷、成本低、灵敏度较高、重现性好、回收率高的特点，与离子色谱法测得结果之间无显著性差异，适用于生鲜乳、原料乳粉及加工后的乳制品中硫氰酸钠的快速测定。

　　参考文献

　　[1] 李滢倩.离子色谱和高效液相色谱测定牛乳中硫氰酸盐含量的研究[D].吉林：吉林大学，2010：2-3.

　　[2] 中华人民共和国国家技术监督局. GB/T 15550-1995活化乳中乳过氧化物酶体系保存生鲜牛乳实施规范[S]. 北京：中国标准出版社，1995.

　　[3] 中华人民共和国卫生部. GB 2760-1996食品添加剂使用卫生标准[S]. 北京：中国标准出版社，1996.

　　[4] 荫硕焱，贺巍巍，赵凯等. 乳品中硫氰酸盐的食品安全对策[J].卫生研究，2013，42(3)：529-631.

　　[5] 王丹慧，张凤梅，李梅等. 铁盐法定量检测原料乳中硫氰酸盐[J]. 食品科学，2010，31(18)：298-300.