固相萃取-气相色谱-三重四级杆串联质谱法测定酱油中3-氯-1,2-丙二醇

摘　要：本实验建立了一种快速测定酱油中3-氯-1，2-丙二醇（3-MCPD）的气相色谱-三重四级杆串联质谱法。样品经固相萃取柱净化，洗脱液经氮气吹干，用乙酸乙酯定容。采用气相色谱-三重四级杆串联质谱法在多反应监测模式（MRM）下测定，外标法定量。本方法的检出限为0.005mg/kg，添加浓度在0.01～0.1mg/kg范围内，平均回收率为86.2%～102.6%，相对标准偏差（RSD）为2.6％～5.7％。该方法准确可靠、简单快速，适用于酱油中3-MCPD的检测。
关键词：气相色谱-三重四极杆串联质谱　固相萃取 3-氯-1，2-丙二醇　酱油

    3-氯-1，2-丙二醇（3-MCPD）是国际公认的食品污染物，其形成与酸水解植物蛋白的加工过程有关。产生酸水解植物蛋白的原料一般为豆粕或菜籽粕，在高温条件下，盐酸与甘油三酯水解的甘油发生化学反应生成3-MCPD。3-MCPD具有生殖、肾脏和神经毒性，还可能具有致癌作用和致突变作用^[1-2]。
    目前，检测酱油中3-MCPD残留量的主要方法有GC法^{[3 -5]}与GC-MS-SIM法^[6-8]，但是3-MCPD结构中含有两个羟基，极性大，未衍生化的3-MCPD色谱行为差，采用GC检测，检测限难以达到检测要求，并且GC法以保留时间为定性依据，这对于复杂目标残留物的鉴定并不可靠。当前，3-MCPD检测的前处理大多采取衍生化处理，由于衍生化反应受到多种因素的影响，使其测定结果变异较大，而且衍生效率不高。与GC-MS-SIM相比，GC-MS-MS的优势在于其采用多反应监测（MRM）模式，解决了GC-MS-SIM模式定性不准的问题，并且具有较强的抗基质干扰能力，可有效降低背景干扰，这使GC-MS-MS在复杂基质背景下仍能对目标化合物进行准确的定性定量分析。本方法采用固相萃取-气相色谱-三重四极杆串联质谱法测定酱油中3-MCPD，未经衍生化处理，具有简单、高效、准确的特点，极大的提升了实验室的检测效率。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
    Agilent 7890B/7000C气相色谱三重四级杆质谱联用仪(美国安捷伦公司)，3-18K高速离心机(德国SIGMA公司)，Turbovap LV氮吹仪（美国caliper公司），IKA MS3涡旋混合器（德国IKA公司）。
    3-MCPD（纯度为98%）标准品购于德国Dr公司；乙酸乙酯、正己烷均为色谱纯，购于德国merck公司；固相萃取小柱Cleanert NCPD 5mL购于天津博纳艾杰尔科技有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液的配制
    准确称取10mg 3-MCPD（精确至0.01mg），用乙酸乙酯溶解，转移至10mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，混匀，配制成1000mg/L的标准储备液，置于4℃冰箱中保存。根据3-MCPD的灵敏度和仪器线性范围，吸取一定量的标准储备溶液，用正己烷稀释成系列浓度的标准工作溶液。
1.2.2 样品前处理
    称取5g（精确至0.001g）酱油直接上样Cleanert NCPD固相萃取柱，平衡10min，以10mL正己烷淋洗，弃去流出液，以15mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液。将洗脱液在40℃下用氮气吹至近干，加入1mL正己烷，混匀至进样小瓶中，供气相色谱三重四级杆质谱联用测定。
1.2.3 仪器的工作条件
    色谱条件：色谱柱DB-WAX（30m×0.320mm ×0.50μm），初始温度50℃，10℃/min升温至180℃，保持5min，30℃/min升温至230℃，保持5min；载气：氦气；流速：1.2mL/min；进样口温度：250℃；进样量：2μL；进样方式：不分流进样。
    质谱条件：电离电压：EI70eV，离子源：230℃，传输线温度：250℃，数据采集模式：MRM，定量离子对79~28（碰撞能量25eV），定性离子对79~43（碰撞能量10eV）。3-MCPD的总离子流色谱图见图1。 2 结果与讨论
2.1 色谱柱的选择
    3-MCPD分子中含有两个羟基，是强极性化合物，未经衍生处理直接分析适合选用极性毛细管柱。本实验选用了HP-5ms、DB-1701、DB-WAX这3种不同极性的色谱柱进行测试。结果表明，3-MCPD在DB-WAX极性上峰形较好，与干扰物达到了较好的分离效果。
2.2 质谱条件优化
    本方法采用多反应监测（MRM）模式检测，最终选取两对离子对作为定量定性离子。为确保3-MCPD在仪器中的响应值最优，本实验对母离子、产物离子的选择以及碰撞电压进行了优化，确定母离子和产物离子后，选取碰撞电压为10～30eV，每隔5eV进行一次碰撞，最终确定定量离子对为79~28（碰撞能量25eV），定性离子对为79~43（碰撞能量10eV）。
2.3 净化提取条件的选择
    由于3-MCPD为强极性化合物，因此本实验选用正己烷作为淋洗液以去除样品中的非极性杂质，分别选择2、4、6、8、10、12mL淋洗溶剂进行淋洗，发现少量溶剂无法起到淋洗作用，10mL以上淋洗效果较好，因此本实验确定以10mL正己烷作为淋洗液。选择极性较大的溶剂作为洗脱液，本研究分别选择了乙酸乙酯、丙酮、乙腈作为洗脱液。分别取上述3种洗脱液各10mL对样品进行洗脱处理。洗脱后测试结果为乙酸乙酯和乙腈的洗脱效果优于丙酮，但是乙腈的沸点较高，氮吹时间较长，易损失。综合考虑洗脱效果、试验时间和试验成本，本实验选择乙酸乙酯作为洗脱液，分别选择5、10、15、20mL洗脱溶剂对酱油样品进行洗脱，氮吹定容后进行GC-MS-MS分析。实验结果表明，洗脱液用量为15mL时，回收率明显大于5mL和10mL，且与20mL的用量相差不大，因此，本实验洗脱液用量选择15mL。
2.4 精密度和准确度
    在最优的实验条件下，3-MCPD溶液在0.01~1.0μg/mL范围内有较好的线性，采用S/N=3计算方法的检出限，本方法的检出限为0.005mg/kg，在低、中、高3个加标浓度水平下，每个浓度水平重复测定5次。平均回收率为86.2%～102.6%，相对标准偏差（RSD）为2.6％～5.7％，结果见表1。 2.5 实际样品检测
    使用本实验方法，对10种出口及本地酱油中的3-MCPD进行检测，其中3种检出含量分别为0.0461mg/kg、0.124mg/kg和0.571mg/kg，检出样品使用GB 5009.191-2016^[9]方法检测，两种方法检出结果一致。
3 结论
    本方法采用固相萃取-气相色谱-三重四极杆串联质谱测定酱油中3-MCPD，未经衍生化处理。相比国标，节约了衍生的时间，避免了衍生实验对结果的影响，具有简单、省时、准确的特点，为酱油中3-MCPD的检测提供了一种简便、可行的方法。
参考文献：
    [1] Anonymous.Food Technology in New Zealand. 2002，37：17-18.
    [2] 曲花玲，姜丽平,于畅，等.3-氯-1,2-丙二醇对人胚肾293细胞DNA损伤作用[J].中国公共卫生，2009，25(11)：1359-1360.
    [3] 李吉平，高宏伟，刘文森等.小口径毛细管色谱柱测定酱油中三种氯丙醇含量的研究[J].食品科学，2007，28(9)：473-477.
    [4] 卢业举，陈戈，夏春.利用大口径毛细管色谱柱测定调味品中氯丙醇含量[J].安徽化工，2002(3)：48-49.
    [5] 廖华勇，鲍伦军.气相色谱同时检测调味品中三种氯内醇的方法研究.中国卫生检验杂志，2001，11(6)：647-650.
    [6] 马金波，张琦，栾燕等.MSPD-GC-MS同时测定酱油及调味液中多组分氯丙醇[J].中国卫生检验杂志，2007，17(4)：383-385.
    [7] 吴小琼，陈中文，管健等.固相萃取-同位素内标GC-MS法测定酱油中的4种氯丙醇[J].中国卫生检验杂志，2014，24(10)：1422-1424.
    [8] 朱国英，徐小民，管健等.GC-MS法快速检测酱油中的3-氯-1,2-丙二醇[J].中国卫生检验杂志，2010，20(5)：1016-1017.
[9] 食品安全国家标准 食品中氯丙醇及其脂肪酸酯含量的测定[S].中华人民共和国国家标准，GB 5009.191-2016．