辣椒制品中苏丹红Ⅰ的快速检测

　　胶体金免疫层析法(KJ201801)

　　1　范围

　　本方法规定了辣椒制品中苏丹红I的胶体金免疫层析快速检测方法。

　　本方法适用于辣椒酱、辣椒油、辣椒粉等辣椒制品中苏丹红I的快速测定。

　　2　原理

　　本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的苏丹红I与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和检测线(T线)上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线(C线)颜色深浅比较，对样品中苏丹红I进行定性判定。

　　3　试剂和材料

　　除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。

　　3.1　试剂

　　3.1.1　乙腈。

　　3.1.2　无水硫酸镁。

　　3.1.3　正己烷。

　　3.1.4　二氯甲烷。

　　3.1.5　氢氧化钠。

　　3.1.6　氢氧化钠溶液(2mol/L)：称取氢氧化钠(3.1.5)8g，用水溶解并稀释至100mL。

　　3.1.7　无水乙醇。

　　3.1.8　复溶液：将无水乙醇(3.1.7)与水按照体积比25:75混匀。

　　3.2　参考物质

　　3.2.1　苏丹红I参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥95%。

　　表1 苏丹红I参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称	英文名称	CAS登录号	分子式	相对分子量
苏丹红I	Sudan I	842-07-9	C16H12N2O	248.28

　　3.3　标准溶液的配制

　　3.3.1　苏丹红I标准储备液(1mg/mL)：精密称取苏丹红I标准品(3.2.1)适量，置于10mL容量瓶中，加入适量乙腈(3.1.1)超声溶解后，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1mg/mL的苏丹红Ⅰ标准储备液。﹣20 ℃避光保存，有效期6个月。

　　3.3.2　苏丹红I标准中间液(1μg/mL)：精密量取苏丹红I标准储备液(1mg/mL)(3.3.1)100μL，置于100mL容量瓶中，用乙腈(3.1.1)稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1μg/mL的苏丹红I标准中间液。

　　3.4　材料

　　3.4.1　固相萃取柱：CNW Poly-sery MIP-SDR固相萃取柱(200mg/3mL)，或相当者。

　　3.4.2　苏丹红I胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为辣椒酱、辣椒油、辣椒粉。

　　3.4.2.1　金标微孔。

　　3.4.2.2　试纸条或检测卡。

　　4　仪器和设备

　　4.1　移液器：200μL、1mL和5mL。

　　4.2　涡旋混合器。

　　4.3　离心机：转速≥4000r/min。

　　4.4　电子天平：感量为0.01g。

　　4.5　氮吹仪。

　　4.6　水浴锅。

　　4.7　环境条件：温度15℃～35℃，湿度≤80%。

　　5　分析步骤

　　5.1　试样制备

　　取适量样品，液体样品或半固体样品充分混匀，固体样品充分粉碎混匀。

　　5.2　试样的提取

　　5.2.1 辣椒酱

　　称取辣椒酱2g(精确至0.01g)于15mL离心管中，加入0.5g无水硫酸镁(3.1.2)和5mL正己烷(3.1.3)提取液，涡旋振荡1min后，4000r/min离心5min。将上清液全部加入到固相萃取柱(3.4.1)中，流出液弃去。再加入6mL正己烷淋洗固相萃取柱，流出液弃去。用2mL二氯甲烷(3.1.4)洗脱固相萃取柱，收集洗脱液吹干。精密加入400μL复溶液(3.1.8)，涡旋混合1min，作为待测液，立即测定。

　　5.2.2 辣椒油

　　称取辣椒油5g(精确至0.01g)于15mL离心管中，加入8mL正己烷(3.1.3)进行提取，涡旋振荡1min后，将上清液全部加入到固相萃取柱中，流出液弃去。再加入6mL正己烷淋洗固相萃取柱，流出液弃去。用2mL二氯甲烷(3.1.4)洗脱固相萃取柱，收集洗脱液吹干。精密加入400μL复溶液(3.1.8)，涡旋混合1min，作为待测液，立即测定。

　　5.2.3 辣椒粉

　　称取辣椒粉3g(精确至0.01g)于50mL离心管中，加入8mL乙腈(3.1.1)提取，涡旋振荡1min后，6000r/min离心5min。转移上清液于10mL离心管中，吹干后加入2mL氢氧化钠溶液(3.1.6)，涡旋混匀30s后置于80℃水浴皂化5min。再加入2mL正己烷(3.1.3)，涡旋萃取30s后，6000r/min离心5min，转移上清液于新的10mL离心管中，加入无水硫酸镁(3.1.2)0.5g，涡旋振荡30s后，4000r/min离心5min，转移上清液于10mL离心管中吹干。精密加入400μL复溶液(3.1.8)，涡旋混合1min，作为待测液，立即测定。

　　5.3　测定步骤

　　5.3.1 试纸条与金标微孔测定步骤

　　吸取200μL待测液于金标微孔(3.4.2.1)中，抽吸5～10次使混合均匀，室温温育3～5min，将试纸条(3.4.2.2)吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，温育5～8min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定。

　　5.3.2 检测卡与金标微孔测定步骤

　　吸取200μL待测液于金标微孔(3.4.2.1)中，抽吸5～10次使混合均匀，室温温育3～5min，将金标微孔中全部溶液滴加到检测卡(3.4.2.2)上的加样孔中，温育5～8min，进行结果判定。

　　5.4　质控试验

　　每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。

　　5.4.1　空白试验

　　称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。

　　5.4.2　加标质控试验

　　准确称取空白试样(精确至0.01g)置于具塞离心管中，加入一定体积的苏丹红I标准中间液(3.3.2)，使苏丹红I添加浓度为10μg/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。

　　6　结果判定

　　通过对比控制线(C线)和检测线(T线)的颜色深浅进行结果判定。目视判定示意图见图1。

　　6.1　无效

　　控制线(C线)不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。

　　6.2　阴性结果

　　检测线(T线)颜色比控制线(C线)颜色深或者检测线(T线)颜色与控制线(C线)颜色相当，表明样品中苏丹红I低于方法检测限，判定为阴性。

　　6.3　阳性结果

　　检测线(T线)不显色或检测线(T线)颜色比控制线(C线)颜色浅，表明样品中苏丹红I的含量高于方法检测限，判定为阳性。

　　6.4　质控试验要求

　　空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。

　　a) 试纸条

　　b) 检测卡

　　图1 目视判定示意图

　　7　结论

　　当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。

　　8　性能指标

　　8.1　检测限：10μg/kg。

　　8.2　灵敏度：灵敏度应≥99%

　　8.3　特异性：特异性应≥85%。

　　8.4　假阴性率：假阴性率应≤1%。

　　8.5　假阳性率：假阳性率应≤15%。

　　注：性能指标计算方法见附录A。

　　9　其他

　　本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。

　　本方法参比标准为GB/T 19681-2005《食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法》。

　　附录A

　　定性方法性能计算表

　　表A.1 性能指标计算方法
 

样品情况a	检测结果b		总数
	阳性	阴性
阳性	N11	N12	N1.=N11+N12
阴性	N21	N22	N2.=N21+N22
总数	N.1=N11+N12	N.2=N21+N22	N=N1.+N2.或N.1+N.2
显著性差异(х2)	c2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21), 自由度（df）=1
灵敏度（p+，%）	p+=N11/N1.
特异性（p-，%）	p-=N22/N2.
假阴性率（pf-，%）	pf-=N12/N1.=100-灵敏度
假阳性率（pf+，%）	pf+=N21/N2.=100-特异性
相对准确度，%c	（N11+N22）/(N1.+N2.)
注： a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果； b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。 N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。 C为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。