液相色谱-串联质谱内标法测定全麦粉中呕吐毒素含量的不确定度评

2021-04-22 16:25:59 来源：食品安全导刊定

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液相色谱-串联质谱内标法测定全麦粉中呕吐毒素含量的不确定度评定

□ 王静马晓静河北省粮油质量检测中心

摘　要：采用液相色谱-串联质谱内标法对全麦粉中呕吐毒素含量的不确定度进行评定，并依据测量不确定度评定的指导文件建立数学模型，对测量重复性、标准曲线、样品前处理、仪器设备等不确定度来源进行分析和评定，得出扩展不确定度为0.19mg/kg，（k=2）。通过评定发现，样品重复性测量、标准溶液配制及样品前处理是该方法不确定度的主要来源。
关键词：液相色谱-串联质谱仪内标全麦粉呕吐毒素不确定度
谷物生长过程中极易受到真菌毒素的污染，这不仅会对粮食产量造成极大影响，还可能给农业经济带来巨大损失[1，2]。呕吐毒素是主要存在于小麦、玉米等粮食及其制品中的真菌毒素，人体食用了被呕吐毒素污染的食物后，会出现恶心、腹泻、呕吐等症状[3]。因此，检测小麦中的呕吐毒素具有非常重要的意义。液相色谱-串联质谱仪在食品安全检测中具有准确度较高、受基质干扰影响小等特点，现已成为检测呕吐毒素的主要方法之一[4]。
此外，为了更加准确地表达分析结果，需要引入测量不确定度（以下简称“不确定度”），其是表征合理地赋予被测量值的分散性，与测量结果相联系的参数[5，6]。当检测结果接近临界值时，不确定度的引入能够更准确地反映真实结果[7，8]。
本实验提取全麦粉中呕吐毒素的过程免去了真菌毒素提取中常用的免疫亲和柱净化处理，提高了提取效率，节省了人工与成本；采用内标法对呕吐毒素进行测定并评定不确定度，建立了液相色谱-串联质谱内标法测定全麦粉中呕吐毒素的不确定度评定方法[9，10]。
1 材料与方法
1.1 试验材料
呕吐毒素（DON）标准储备液（103±1.2μg/mL），Sigma-alorich；稳定同位素13C15-DON标准溶液（2μg/mL），国家粮食和物资储备局科学研究院；乙腈（色谱纯）迪马科技；甲酸（质谱级），Sigma；乙酸（色谱级），Fisher；蒸馏水，屈臣氏。

1.2 仪器和设备
QTRAP-5500型液相色谱串联质谱仪（配有电喷雾离子源），美国AB公司；X1R型高速冷冻离心机，美国热电公司；PL602-L型分析天平，梅特勒-托利多（上海有限公司）；IKA涡旋混合器，广州艾卡；QB-212型摇摆式混匀器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；JSFM-Ⅱ型粮食水分测试粉碎磨，中储粮成都粮食储藏科学研究所。
1.3 实验方法
1.3.1 标准工作曲线的配制
使用1mL移液枪移取1mL呕吐毒素标准储备液于100mL容量瓶中，用初始流动相（乙腈︰水=3︰97）定容，得到呕吐毒素标准使用液浓度为1030ng/mL，储存于4℃冰箱。
分别准确移取312.5、625、1250、2500、5000μL呕吐毒素标准使用液于10mL容量瓶中，加入初始流动相稀释并定容至刻度，得到标准工作曲线的浓度分别为32.19、64.38、128.75、257.5、515ng/mL。

1.3.2 样品前处理过程
准确称取5g（精确到0.01g）试样置于50mL离心管中，加入20mL提取液（乙腈︰水︰乙酸=70︰29︰1），涡旋混匀后置于摇摆式混匀器中振荡30min，以6000r/min离心10min，吸取0.5mL上清液于1.5mL离心管中，加入0.5mL水并涡旋混匀，在4℃下以12000r/min离心10min，上清液过0.2μm的聚四氟乙烯滤膜。分别吸取180μL滤液和标准系列工作曲线于含有20μL稳定同位素内标工作液的插管中，涡旋混匀，进行液相色谱-串联质谱测定。
1.3.3 色谱条件
色谱柱：C18柱（柱长100mm，柱内径2.1mm，填料粒径1.7μm）；流速：0.4mL/min；柱温：35℃；进样量：2μL。流动相：A相，水（0.1%甲酸）；B相，乙腈（0.1%甲酸）；梯度洗脱。
梯度洗脱程序：0~0.5min，3%B；0.5~1.0min，3%~10%B；1.0~6.0min，10%~90%B；6.0~7.5min，90%B；7.5~7.6min，90%~3%B；7.6~9.0min，3%B。
质谱条件：电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）离子源，正离子扫描；多反应监测（multi-reaction monitor，MRM）模式；离子源温度：600℃；质谱参数见表1。

2 结果与分析
2.1 数学模型

式中：X为样品中呕吐毒素的含量（μg/kg)，ρ为计算得到测定液中呕吐毒素的质量浓度（ng/mL），V为加入提取液的体积（20mL），f为稀释液稀释因子2，m为样品质量5g。

2.2 不确定度分量的来源分析
根据数学模型及实验过程，液相色谱-串联质谱内标法测定全麦粉中呕吐毒素含量的不确定度来源有以下几个方面：①样品重复实验引入的不确定度；②样品质量称量引入的不确定度；③标准储备液自身的不确定度；④标准溶液稀释、工作曲线配置、标准曲线最小二乘法拟合产生的不确定度；⑤样品制备、提取及稀释过程产生的不确定度；⑥液相色谱-串联质谱仪的不确定度。此外，同位素内标13C15-DON引入的不确定度主要体现在标准工作曲线的配制及样品的内标溶液的加入，因此可忽略不计。

2.3 不确定度分量的评定及计算
2.3.1 样品重复实验引入的不确定度
在重复性测定条件下，对阳性样品进行6次测定，测定结果见表2。

2.3.3 标准溶液引入的不确定度
2.3.3.1 标准储备液自身的不确定度

2.3.3.2 工作曲线配制引入的不确定度
工作曲线配制过程的不确定度主要来源于量器自身的误差，以及溶剂在使用过程中因环境温度引起的体积变化。依据《常用玻璃量具检定规程》（JJG 196-2006）及《移液器检定规程》（JJG 646-2006）的要求，玻璃量器及移液枪对应的最大允许误差按B类评定，服从矩形分布，；200μL移液枪的最大允许误差为0.003mL，1mL移液枪的最大允许误差为0.01mL，工作曲线配制过程中量器引入的不确定度见表3。

实验室的温度变化范围通常为（20±5）℃，考虑到液体的体积膨胀，20℃时纯水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃，标准工作曲线用初始流动相定容，其膨胀系数与纯水相当——近似于2.1×10-4℃，温度波动按矩形分布计算，，则标准工作曲线配制过程中的相对标准不确定度可合成为：

2.3.4 标准工作曲线拟合引入的不确定度
采用6个浓度梯度的呕吐毒素标准工作曲线，分别用液相色谱-串联质谱内标法重复测定2次，以浓度比为横坐标，峰面积/内标峰面积比为纵坐标，利用数据处理软件拟合得到线性回归方程为yi＝a×xi+b，式中：a为斜率、b为截距，测定结果及数据计算见表4。

则由工作曲线拟合所产生的不确定度计算公式如下：

2.3.5 样品稀释过程的不确定度
稀释过程中使用20mL单标吸量管量取提取液，提取液经提取、离心后，用1mL移液枪吸取0.5mL过滤液，并用0.5mL水稀释，过滤后进质谱仪测定。依据《常用玻璃量具检定规程》（JJG 196-2006）的要求，20mL单标吸量管的最大允许为误差按B类评定，服从矩形分布，k= 。提取液中由于乙酸的加入量为微量，故可忽略温度波动引起的乙酸体积变化。因此，温度波动引起提取液的体积变化为（1.2×10-3 ×0.7+2.1×10-4×0.29）×5×20=0.0901mL，按均匀分布计算，

，合成相对标准不确定度分量见表5。

2.3.6 液相色谱-串联质谱仪的不确定度
由液相色谱-串联质谱仪校准证书提供的峰面积重复性不确定度为1.1％，k=2，则由仪器引入的相对不确定度为：

3 标准不确定度的合成与扩展
3.1 合成相对标准不确定度
样品测量重复性、样品称量、标准溶液配制、标准曲线拟合、样品稀释、液相色谱-串联质谱仪等不确定度分量值，见表6。

将各分量合成计算全麦粉中呕吐毒素的相对合成标准不确定度为：

3.2 合成标准不确定度
全麦粉中呕吐毒素的含量为2.441mg/kg，相对合成标准不确定度为：U(W)=2.441×0.0393=0.0959mg/kg。

3.3 扩展不确定度
扩展不确定度（U），通过使用包含因子k=2，计算得到：U=U(W)×2=0.0959×2=0.19mg/kg。
全麦粉中呕吐毒素的含量为（2.441±0.19）mg/kg，k=2。

4 结论
本试验采用液相色谱-串联质谱内标法测定全麦粉中的呕吐毒素，该方法免去了传统免疫亲和柱净化步骤，减化了样品前处理过程，通过液相-质谱内标法进行定量，提高了实验结果的准确性。通过对各个不确定分量的评定及分析可以看出，样品重复性测量、标准溶液配制及样品稀释是该方法不确定度的主要来源，由于采用内标法定量，因此忽略了回收率的不确定度。通过评定实验过程的不确定度，可以有效地控制关键步骤，进而减小样品检测过程中的偏差，达到更准确测定样品结果的目的。

参考文献：
[1] 曹慧英，伍松陵，孙长坡.呕吐毒素（DON）生物合成和降解研究进展［J］.中国粮油学报，2013，28(5):116-122.
[2] 霍星华，赵宝玉，万学攀等.脱氧学腐镰刀烯醇的毒性研究进展［J］.毒理学杂志，2008，22(2):151-154.
[3] 武传欣，程小丽，孙伟等．粮食中呕吐毒素的研究进展[J].粮食加工，2016，41(4):48-51.
[4] 林广沅，柏文良，李芸.液相色谱-串联质谱内标法测定花生油中黄曲霉毒素B1含量的不确定度评定[J].广东化学，2020，13(46):184－189.
[5] 国家质量技术监督局计量司.测量不确定度评定与表示指南[M].北京:中国计量出版社，2001.
[6] 中国实验室国家认可委员会.化学分析中不确定度的评估指南[M].北京:中国计量出版社，2002:11-32.
[7] 吴旻丹，罗洪浩.免疫亲和柱-高效液相色谱法测定小麦中呕吐毒素方法研究及不确定度评价[J].粮食加工，2018，43(2):79-81.
[8] 胡玲，马侦，王如坤等.高校液相色谱-串联质谱法测定甘草中赭曲霉毒素A的不确定度评定[J].食品安全质量检测学报，2020，11(12):3965-3969.
[9] 测量不确定度评定与表示（JJF 1059.1-2012）[S].
[10] 常用玻璃量器（JJG 196-2006）[S].

作者简介：王静（1982-），女，汉族，工作单位：河北省粮油质量检测中心，职称：高级工程师，学历：硕士，研究方向：粮油质量检测。