《食品安全导刊》刊号:CN11-5478/R 国际:ISSN1674-0270

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腰果蛋白的提取率工艺优化探析

2017-01-16 16:24:25 来源: 食品安全导刊

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  摘要:将腰果作为提取原料,对腰果仁主要成分进行分析,来对不同提取方法呈现的蛋白质提取率影响进行研究;将提取液pH值、料液比、提取温度和时间作为单因素,使用正交试验、单因素设计,来对腰果蛋白提取工艺进行最佳优化。结果:腰果仁中的粗脂肪成分含量最高,为44.13%,其他含量分别为:碳水化合物27.22%、蛋白质19.41%、膳食纤维3.72%、水分3.07%,灰分2.45%;从研究来看,碱提取法的提取率最高,其最佳工艺条件料液比为1:40(g/mL)、提取液pH9、提取温度35℃、提取时间为1.5h,在该提取条件下,腰果蛋白提取率为79.0%。本文实验主要是将腰果仁作为原料,来对其中存在的主要成分进行分析。

  1材料与方法

  1.1材料与试剂

  腰果为从某大型超市中购置的普通腰果,并将其在0~4℃环境下贮藏。

  所用试剂均为国产分析纯。

  1.2仪器与设备

  DHG-9143BS-III型电热恒温鼓风干燥箱——上海新苗医疗器械制造有限公司;SX-5-12型箱式电阻炉——天津市泰斯特仪器有限公司;KDN-DI型自动定氮仪——上海新嘉电子有限公司;UV-1801型紫外可见分光光度计——北京瑞利分析仪器有限公司;SC-3610型低速离心机——安徽中科中佳科学仪器有限公司;HSJ系列数显恒温水浴锅——金坛市科析仪器有限公司。

  1.3方法

  1.3.1原料营养成分的测定

  水分含量测定:采用常压干燥法,GB/T5009.3—2010《食品中水分的测定》;灰分含量测定:采用灼烧法,GB/T5009.4—2010《食品中灰分的测定》;蛋白质含量测定:采用凯氏定氮法,GB/T5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》;粗脂肪含量测定:采用索氏提取法,GB/T14772—2008《食品中粗脂肪的测定》;膳食纤维含量测定:采用酶重量法,GB 5009.88-2014;碳水化合物含量测定:采用《预包装食品营养标签通则》(GB 28050-2011)问答(修订版)的方法。

  1.3.2蛋白质含量的测定

  蛋白质的具体含量测定:使用考马斯亮蓝Bradford法,将牛血清蛋白作为标准的蛋白,运用考马斯亮蓝G-250染色,其得到的标准曲线方程为:Y=0.0046X-0.0125,R2=0.9964。运用以下公式对腰果蛋白提取率进行计算。

  1.3.3原料处理及蛋白提取

  1.3.3.1原料预处理

  将腰果仁在粉碎机中粉碎处理,放置在干燥器中干燥,使用石油醚脱脂[2],最终得到腰果粉。

  1.3.3.2

  腰果蛋白质的具体提取方法涉及到以下三种:

  ①Tris-HCl法[1]:取用脱脂后的腰果粉1g,在其中加入50mL 0.2mol/L pH 8的Tris-HCl缓冲液,在45℃的温度条件下搅拌浸提6h,在4000r/min条件下离心15min,最终取上清液测定蛋白质含量。

  ②盐溶法:取用脱脂处理后的腰果1g,向其中加入50mL 0.14mol/L的NaCl溶液,放置在45℃的温度条件下搅拌浸提6h,在4000r/min转速下条件下离心15min,最终取上清液测定蛋白质含量。

  ③碱溶酸沉法:选用脱脂后的腰果粉样1g,向其中加入50mL的蒸馏水,用0.01mol/L的NaOH溶液调pH值至10,将其放置在45℃条件下搅拌浸提6h,在4000r/min条件下离心15min,最终取上清液测定蛋白质含量。

  1.3.4蛋白质提取工艺的确定

  1.3.4.1单因素试验设计

  最终确定使用碱提法,在相关条件达到一定时,其料液比则使用1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60(g/mL)这6个水平层次,0.01mol/L的NaOH溶液调节提取液pH值7、8、9、10、11、12共6个水平,提取温度采用25、30、35、40、45、50℃共计6个水平,提取时间采用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h共5个水平,来分别进行相应的单因素试验。

  1.3.4.2正交试验设计

  根据单因素试验结果,选择料液比、提取液pH值、提取温度、提取时间进行四因素三水平L9(43)正交试验,试验设计见表1。

  表1 正交试验因素与水平

  水平 因素

  料液比(g/mL) pH 提取温度/℃ 提取时间/h

  1 1:30 7 30 1.0

  2 1:40 8 35 1.5

  3 1:50 9 40 2.0

  2结果与分析

  2.1腰果原料基本成分分析

  从表2上,能够明显看出的是,粗脂肪含量是腰果仁成分含量占比最高的,达到44.13%,碳水化合物则为27.22%,蛋白质为19.41%。

  表2 腰果原料基本成分分析

  成分 粗脂肪 蛋白质 膳食纤维 碳水化合物 水分 灰分

  含量/% 44.13 19.41 3.72 27.22 3.07 2.45

  2.2提取方法的选择

  从以往的实验来看,在腰果蛋白提取方法选择上,不同的提取方法,提取率也有所差异:碱溶法相比于盐溶法和Tris-HCl法,所呈现出的蛋白质提取率更为显著,提取率为40.09%(P<0.05),盐溶法提取率最低,为20.15%。因此,本文实验采取了碱提法。大量研究证明,碱能够让腰果的结构变得更为疏松,从而有效的打破了大分子间的部分氢键,并提高了蛋白溶解度,促使其提取率得到提高。

  2.3单因素试验

  2.3.1料液比对腰果蛋白质提取率的影响

  从实验来看,当选取温度为45℃、时间1h、pH9的情况下,将料液比作为变量进行3次平行试验后,料液比从1:10~1:40(g/mL)的过程中,其蛋白质提取率有了明显的上升趋势。而料液比在1:40(g/mL)的情况下,其提取率得到显著提升,最大达到56.32%(P<0.05)。

  伴随着提取液使用量的不断提升,提取率开始不断下降,降低为33.05%。导致这一结果的原因,可能在于溶液体积不断增大、溶剂增加,原料中的内外蛋白质浓度差也开始提高,蛋白质也就越容易渗入到提取液中,提取率也得到了相应增大。而当提取液使用量不断增长时,蛋白质溶液开始出现饱和,加水量过多,酸沉过程中上清液所残留的清蛋白量明显提升,蛋白质的损失量开始出现提高,反而使得提取率下降。故此,选择料液比应当为1:40(g/mL)。

  2.3.2 pH值对腰果蛋白质提取率的影响

  当选取的料液比为1∶40(mg/mL)、温度45℃、时间1h时,将pH值作为变量来进行3次平行试验。从结果来看,提取液pH值从7上升到10的情况下,腰果蛋白质提取率会伴随着pH值的提升而不断提升,最高能够达到53.25%(P<0.10),而随着pH值的不断提升,其提取率便开始出现下降。这主要是由于碱本身能够让腰果结构变得更为疏松,打破了蛋白质分子之间的部分氢键,以此使得蛋白质与淀粉发生分离,从而提升了蛋白质提取率,而伴随着pH值持续增大,蛋白质在强碱环境下更容易出现水解、变性,过程中蛋白质的颜色也会变深,如若蛋白质长时间受到强碱影响,则会发生“胱赖”反应,并生成有毒化合物。故此,实验的pH值最佳范围在9-10左右。

  2.3.3提取温度对腰果蛋白质提取率的影响

  当选取料液比为1:40(mg/mL)、pH9、时间1h时,将温度作为变量进行3次平行实验。结果发现,不同提取温度,对于蛋白质提取率影响显著。当提取温度在25~35℃范围时,提取率开始不断上升,从56.00%上升至61.07%,而伴随着温度变量的持续提高,提取率开始降低到54.73%。其原因在于35℃前,温度上升的同时,亲水基团逐渐展开,巯基含量得到提升,蛋白质溶解度持续升高;而随着温度的不断上升,疏水基团被展开、暴露,导致蛋白质分子出现聚集,溶解度明显下降,从而影响到提取率的下滑。而当温度上升到一定范围,蛋白质还可以发生变性。故此,实验提取温度范围应当在35℃左右。

  2.3.4提取时间对腰果蛋白质提取率的影响

  当选取1:40(mg/mL)、温度45℃、pH9的情况下,将浸提时间作为变量来进行3次平行试验。从结果来看,在1.5h前,腰果蛋白提取率会伴随着时间的不断延长而持续提升,从48.27%上升到63.93%(P<0.05),而在1.5h之后,提取率便开始出现了下降趋势,下降到55.47%。这主要是由于去脂腰果粉本就需要耗费一定溶胀时间,在充足的溶胀时间下,才有利于蛋白质的分离溶解,但如果提取时间过长,浸提液中的已溶蛋白质出现了饱和现象,开始随着疏水基团的暴露,蛋白质出现凝聚沉淀现象,从而促使提取率开始降低。

  2.4腰果蛋白质提取条件优化

  在单因素试验基础上做正交试验,优化提取工艺。正交试验结果见表3。

  表3 腰果蛋白提取条件优化的正交试验结果

  试验号 A B C D 蛋白质提取率/%

  1 1 1 1 1 58.50

  2 1 2 2 2 70.77

  3 1 3 3 3 73.27

  4 2 1 2 3 69.74

  5 2 2 3 1 71.75

  6 2 3 1 2 78.51

  7 3 1 3 2 59.36

  8 3 2 1 3 65.48

  9 3 3 2 1 70.63

  K1 67.51 62.53 67.50 66.76

  K2 73.13 69.13 70.38 69.55

  K3 65.16 74.14 67.93 69.50

  R 7.98 11.60 2.88 2.79

  表4 正交试验结果方差分析表

  因素 偏差平方和 自由度 F值 F0.05 F0.01 显著性

  A 100.77 2 10.23 19 99.00

  B 203.23 2 20.61 19.00 99.00 *

  C 14.62 2 1.47 19.00 99.00

  D 15.26 2 1.55 19.00 99.00

  误差 9.85 2

  注:*.差异显著(P<0.05)。

  选取料液比(A)、提取液pH值(B)、提取温度(C)、提取时间(D)4个因素,以腰果蛋白的提取率为指标,得出优化条件。从表3极差R值可以得出,对腰果蛋白提取率影响因素由大到小依次是B>A>C>D,即pH值对腰果蛋白的提取率影响最大。可以得出,最佳工艺条件为A2B3C2D2,即料液比1:40(g/mL)、提取液pH9、提取温度35℃、提取时间1.5h。由表4方差分析结果表明:pH值为影响腰果蛋白质提取过程的显著因素,料液比、提取时间、提取温度为不显著因素。根据最佳工艺条件对腰果蛋白进行提取,测得腰果蛋白的提取率可达79.0%。

  使用最佳的提取方法碱提法,利用单因素、正交试验得出腰果蛋白提取的最佳工艺条件是:料液比1:40(g/mL)、提取液pH9、提取温度35℃、提取时间1.5h,在此条件下所得到的腰果蛋白提取率能够达到79.0%。

  参考文献

  [1]叶婧,曾育蒙,王秀丽,李建平. 腰果蛋白的提取及功能特性研究[J]. 食品研究与开发,2016,06:43-49.

  [2]殷贺中. 不同种脱脂榛子粉、榛子蛋白粉理化性质比较研究[D].河南农业大学,2013.

  胡蓉 江苏省生产力促进中心理化测试中心

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