《食品安全导刊》刊号:CN11-5478/R 国际:ISSN1674-0270

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鱼肉中硝基呋喃的检测分析

2017-01-16 16:30:44 来源: 食品安全导刊

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  硝基呋喃是一种高效抗生素药物,也被非法当做鱼、猪等动物的生长促进剂使用。研究发现,硝基呋喃具有致癌和致突变的作用。硝基呋喃类药物的检测方法有ELISA法度法、高效液相色谱法和HPLC-MS法。硝基呋喃药物在体内与蛋白结合生成的代谢物较稳定,因此检测硝基呋喃类药物一般是测定其代谢物,其中呋喃唑酮的代谢物是3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)。本实验以HPLC-MS法为对照实验比对ELISA法测定的27份市售鱼肉样品,从而验证ELISA法在硝基呋喃快速检测中的有效性、可靠性,为食品监督执法提供参考。

  器材 高效液相色谱-串联质谱仪(Waters TQ-S),酶标仪(ThermoFisher multiskan);离心机(Lynx 6000),涡旋振荡器(pro250),氮吹仪。

  试剂 硝基呋喃检测试剂盒(COKDA0300),AOZ标准溶液(Sigma-Aldrich公司),60%甲醇,1mol/L盐酸,50mmol/L2-硝基苯甲醛二甲基亚砜溶液,0.1mol/L磷酸氢二钾溶液,1mol/L氢氧化钠,20%甲醇溶液,1mol/L盐酸,2-硝基苯甲醛亚甲基二砜溶液。

  实验 供试品溶液:HPLC-MS法:称取2g样品,加10mL60%甲醇匀浆2min,离心后弃去上清液,加8mL甲醇洗涤1次,8mL乙醇洗涤1次,8mL乙醚洗涤1次。取标准溶液AOZ使其最终浓度0.5、1、2、4、10ng/mL。每个离心管加入水4mL、1mol/L盐酸1mL、50mmol/L2-硝基苯甲醛溶液0.15mL,混匀。37℃避光16h。加0.1mol/L磷酸氢二钾溶液5mL,用1mol/L氢氧化钠调PH=7.2~7.4。加乙酸乙酯5mL,涡旋5min。离心后取上清液于50℃氮气吹干。加20%甲醇溶液0.5mL溶解,滤过待测。

  ELISA法:取匀质后的样品1g,加水4mL,1mol/L盐酸0.5mL,10mmol/L2-硝基苯甲醛溶液。37℃置16h,加0.1mol/L磷酸氢二钾溶液5mL,加1mol/L氢氧化钠0.4mL和乙酸乙酯5mL,涡旋30s,离心后取上清液,60℃下氮气吹干,加正己烷1mL和稀释液1mL,涡旋1min,离心后去下层50uL,待测。

  ELISA法:微孔板回温,分别加标准品和样品50uL,所有微孔加入25 uLAOZ-HRP,25 uLAOZ抗体溶液,密封。混匀孵育1h后倒掉溶液重复3次加300 uL缓冲液,冲洗缓冲液的步骤,加150 uLTMB底物避光孵育30min,加50 uL终止液,放入酶标仪在λ=450和630nm下读数。

  测定 HPLC-MS法 液相色谱条件:色谱柱Waters BEH(2.1 mm×50 mm,1.7μm);柱温:30℃。进样体积:5.0μl;流速:0.25 ml/min。流动相:0.1%乙酸水(A)和乙腈溶液(B),梯度洗脱:0min,80%;A=8.5min,A=40%;11min,A=10%。

  质谱条件:电离方式ESI(+);毛细管电压1.5 KV;离子源温度120℃;锥孔反吹气氮气100 L/h;去溶剂气氮气温度350℃;去溶剂气流量800 L/h;碰撞气氩气流速0.25 ml/min。m/z=236/134的锥孔电压和碰撞电压为25V和13eV,m/z=236/104的锥孔电压和碰撞电压为25V和18eV。

  结果 27份样品使用两种方法进行检测后,定性结果相同。37份检测结果均为阴性,阳性检出率达到0%,样品合格率为100%。方法的回收率和精密度见表一。

  表一 AOZ添加回收率和精密度(n=6)

  方法 添加量

  (ug/kg) 测得量

  (ug/kg) 回收率

  (%) 相对标准偏差

  (%)

  HPLC-MS法 0.5 0.473 94.6 6.7

  1.0 1.065 106 7.2

  5.0 4.621 92.4 7.9

  ELISA法 0.5 0.578 116 10.6

  1.0 0.812 81.2 14.9

  5.0 4.049 8.10 17.4

  本文对27份样品进行检测,将HPLC-MS法来作为对照方式,对比ELISA法的检测结果。两种检测方法的定性结果相同,但是HPLC-MS有较好的回收率和精密度。ELISA法由于孵育温度和时间需要精准控制,在大批量样品处理时,可能会影响其结果准确度。因此,HPLC-MS是作为测定鱼肉中硝基呋喃的确证、定量的最可靠方法。

  虽然ELISA法只是半定量检测方法,但由于其检测限低、易于操作等优势,外加其不受到其他成分干扰,非常适合在批量普查工作中初筛,这对于实验室快速初筛定性鱼肉中的硝基呋喃有积极作用。

  马青青 许文清

  河南省疾病预防控制中心 铁道警察学院

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