高效液相色谱法的特点。流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压；分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时；分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍；紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级；百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。用一根柱子可分离不同化合物；样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。

米粉中次硫酸氢钠甲醛的检测

检测仪器主要有：Agilent1100高效液相色谱仪;HY-5回旋式振荡器;800电动离心机;双功能水浴恒温振荡器。所需试剂主要有：甲醛标准溶液由36%～38%甲醛配制成40μg/mL标准储备液,经硫代硫酸钠标定浓度后,置于4℃冰箱中保存一个月,使用时临时稀释成所需浓度;2,4-二硝基苯肼经纯化后称取0.2g,加乙腈溶解定容至100mL,配制成2g/的衍生试剂,置于棕色瓶中;磷酸氢二钠称取18g加水溶解定容至100mL。正己烷、盐酸、氯化钠等以及二次蒸馏水。样品提取取适量米粉（10g），粉碎后加入100mLHCl—NaCl溶液震荡提取40min。将提取液转移到离心管中于4000r/min离心30min，上清液备用。衍生化 取2mL样品提取液至25mL比色管中，并加入1mL磷酸氢二钠溶液、0.5mLDNPH衍生试剂，均匀混合后定容至10mL,60℃水浴衍生20min。标准溶液与样品同时进行衍生。衍生产物2,4-二硝基苯腙用正己烷萃取2次,每次5mL,合并萃取液浓缩至5mL，上机测试。标准曲线 分别取2μg/mL的甲醛使用液0.00、0.25、0.5、1、2、4mL于25mL具塞比色管中,加2mLHCl-NaCl溶液、1mL磷酸氢二钠溶液、0.5mLDNPH衍生试剂,混合均匀,定容至10mL,60℃水浴衍生20min。正己烷萃取后取10μL进样。根据保留时间定性,峰面积定量,每个浓度重复做两次,取平均值,以峰面积与甲醛浓度,绘制标准曲线。取样品萃取液10μL注入HPLC测得积分面积后从标准曲线查出相应的浓度,计算甲醛含量。HPLC上机测定 AgilentHPLC1100带紫外检测器(DAD);色谱柱:ZORBAX SB C18,150mm×4.6mm×5μm;流动相:乙腈∶水=60∶40(v/v);流速:0.8mL/min;检测波长:355nm;柱温:25℃;进样量:10μL;运行时间:7min。

由于所采集的米粉样品中未检出有甲醛次硫酸氢钠，因此在样品中加入甲醛次硫酸氢钠标准品，米线样品加标的离子色谱图如下图所示。根据色谱图可知，样品中的其它杂质对甲醛次硫酸氢钠无影响，甲醛次硫酸氢钠的分离度较好。采用的淋洗方式为梯度淋洗，在13min后基线有向上飘的趋势，但不影响甲醛次硫酸氢钠的定性、定量，甲醛次硫酸氢钠出峰的位置(5min左右)基线较平稳。

高效液相色谱法测定米粉中次硫酸氢钠甲醛吸收色谱图

测定条件选择 改变流动相配比可以进一步改变杂质峰与甲醛衍生物的分离度,在实验中可以发现发现乙腈水为60∶40,流速为0.8mL/min,分离效果最好。通过最大吸收波长扫描验证了波长在355nm处吸收峰最大,检测波长选为355nm。

线性范围与线性方程 通过上述实验步骤得到如下图的以甲醛含量(μg)为横坐标，甲醛衍生物苯腙的峰面积为纵坐标的标准工作曲线。线性方程y=73.4054x+11.2965，相关系数0.9996，在0.5～8μg范围内线性关系良好，最低检测浓度为1μg(S/N=3)，以取样量10g计，本法对样品的检出限为0.1μg/g。通常甲醛或吊白块作为食品添加剂在食品中的加入量远高于10mg/kg才有防腐的效果,故此方法检出限完全满足食品分析的要求。

高效液相色谱测定甲醛标准曲线

衍生条件优化 甲醛与2，4—二硝基苯肼的衍生反应速度较慢，衍生时间对测定结果影响很大。固定其他条件如水浴温度60℃，衍生试剂用量为2g/L,考察了衍生时间从15、20、30、40、60min对测定结果的影响。结果表明，甲醛衍生物的峰面积随着衍生时间的增加而增大,20min后趋于稳定，实验选择衍生时间为20min。甲醛与2，4—二硝基苯肼反应生成黄色的2，4—二硝基苯腙，先后用5mL正己烷萃取，即可将萃取层萃取近无色,将衍生产物几乎萃取完全。

质量标准中的系统适用性试验，最好能将最难分离的杂质订入系统适用性试验用溶液的配制，将此杂质的浓度配制为主成分浓度的1%、0.5%、0.2%进行试验，验证分离度后，再进行样品的测定，以确保试验的准确进行。质量标准中，应配制系列浓度的对照溶液，以对杂质有“半定量”的概念，这可更好地评价杂质存在的情况；并应规定杂质的个数及最大杂质斑点的限度，使质量标准更完善、科学。错误的一种误区，认为HPLC法完全替代了TLC法，这是不正确的，一定要做到相互补充、相互论证、相互参考才是最客观、最科学的。

徐体华 广安市产品质量检验所