《食品安全导刊》刊号:CN11-5478/R 国际:ISSN1674-0270

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水产品快检技术在兽药残留方面的研究进展

2017-11-20 16:42:03 来源:

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□ 李云 石家庄市畜产品质量监测中心
□ 陈笑笑 王伟萍 杭州南开日新生物技术有限公司
    水产品是人们生活中的重要食物来源,它的安全问题备受关注,其兽药残留问题更是敏感,目前已有多种快检技术应用于水产品兽药残留领域的检测。本文主要概述了化学比色法、酶联免疫法、胶体金免疫层析法和量子点荧光免疫分析法等多种快检技术在水产品兽药残留检测方面的研究进展。
    我国是世界上水产品产量最大的国家之一,作为餐桌上的佳肴,伴随水产品需求量的不断增长,安全问题也日趋严峻。水产品的安全风险主要来源于水体中的消毒剂、重金属及饲料中的农药和兽药残留,其中,兽药残留问题较为突出。为避免水产品安全事故的发生,有效的兽药残留检测技术必不可少。
快速检测技术
    目前,常规的检测方法多为仪器分析法,其灵敏度和准确度都比较高,但存在费用高、检测周期长等问题,无法满足现场快速检测的需求,因此,简单快速的检测技术具有广阔的应用前景。本文对化学比色法、酶联免疫法、胶体金免疫层析法和量子点荧光免疫分析法等多种快检技术在水产品兽药残留检测方面的研究进展作一综述。
放射免疫测定法
    1959年,Yelow等建立了放射免疫测定法(RIA),其基本原理是标记抗原和非标记抗原对专一抗体的竞争抑制作用,利用了放射性示踪的灵敏度和抗原-抗体反应的特异性。李佐卿等利用放射免疫法来检测鱼肉和鸡肉中磺胺类药物的残留量,其中对鱼肉样品加标10μg/kg进行了18次测定,精密度为5.4%,测定低限能达到10μg/kg。陈键等研究了放射免疫法检测鳗鱼中磺胺类药物残留,验证了磺胺类药物在最大残留限量50μg/kg时的检测稳定性,并且90min即可得到检测结果。陈小雪等采用放射免疫法对水产品中氯霉素残留进行了分析,检测低限为0.15μg/kg。郑晶等利用放射免疫法快速筛检烤鳗中四环素类药物残留,检测限为50μg/kg。目前,放射免疫测定法以其高灵敏度已被广泛应用于多个领域。
酶联免疫吸附法
    1971年,瑞典学者Engvail和Perlman与荷兰学者Van Weerman和Schuurs几乎同时建立了检测体液中微量物质的固相免疫测定方法,即酶联免疫法(ELISA),其基本原理是酶与抗体或抗抗体共价结合,形成酶标记复合物,再与相应的抗原形成酶标记的抗原抗体复合物,然后相应的底物在酶的催化下反应生成另一种有色产物。
    周大勇建立了诺氟沙星的竞争性酶联免疫吸附测定法,其检测范围为10~500ng/mL,最小检测浓度为4.6ng/mL。同时,周大勇测定了9种诺氟沙星类似物和一些抗菌素的交叉反应率,其中洛美沙星的交叉反应率最高,达到了64.18%,其余8种类似物的交叉反应率均小于10%。采用这种方法测定草鱼鱼肉中的诺氟沙星含量,回收率为82.06%。李雅丽建立了基于多克隆抗体的间接ELISA方法来检测喹诺酮,该法可用于猪肉和鱼肉组织中19种喹诺酮类药物的检测,效果良好。
    Umaporn等利用ELISA法测定虾中5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)的残留,检出限为0.16μg/kg。Jester Edward等使用R-Biopharm公司生产的ELISA试剂盒检测了鱼肉样品中的硝基呋喃药物残留,与使用LC-MS-MS检测的结果吻合度较高。李亚楠等建立了测定呋喃妥因代谢物的直接竞争酶联免疫法,线性检测范围为0.177~11.508ng/mL,其中鱼肉的最低检测限为0.109μg/kg。
    郑晶利用酶联免疫法来测定鳗鱼中恩诺沙星的残留量,当样品浓度为0.3~ 10μg/kg时,最低检测限为3μg/kg;当样品浓度增加至25~100μg/kg时,回收率为66.5%~76.6%,灵敏度为0.3μg/kg。刘晓红等利用酶联免疫法测定鲤鱼中恩诺/环丙沙星的残留量,当浓度为10~810mg/kg时,最低检测限为10μg/kg;当样品添加浓度为20~500μg/kg时,回收率为76.6%~80.9%。李宗妍等建立了一步法酶联免疫法测定水产品中恩诺沙星的残留,检测限为10μg/kg,在10~40μg/kg浓度范围内,检测回收率可达70%以上,检测时间缩短至2h以内。冯婷婷等利用抗恩诺沙星单克隆抗体建立了酶联免疫吸附法用来检测动物源性食品中恩诺沙星的残留,检测范围为0.5~50μg/L,最低检测限为0.2μg/L,在鸡肉、鱼肉、虾和蜂蜜样品中的回收率为93.3%~122.7%。
    酶联免疫吸附法的特异性强,且简便快速,在水产品兽药残留快速检测方面应用广泛,许多公司已具有商品化产品。酶联免疫吸附法作为目前研究较为成熟的快检方法,在市场上占有较大份额。
胶体金免疫层析法
    1971年,Faulk和Taylor首次将胶体金应用于免疫分析。此后,Osikowicz和Beggs等将胶体金免疫层析技术应用于人类绒毛腺激素的定性检测中,其基本原理是以胶体金(红色)作为示踪标记物,让其与蛋白质等多种大分子物质结合,再利用抗原抗体反应达到检测目的。
    韩静等首次建立了同时检测猪肉、鸡肉、鲫鱼中磺胺异噁唑、磺胺噻唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺氯哒嗪的多残留免疫胶体金试纸条检测方法,视觉检测限为0.01mg/kg,检测时间小于10min。冯婷婷等建立了同时检测11种喹诺酮类药物的胶体金免疫层析方法,对猪肉和虾中恩诺沙星、环丙沙星和氧氟沙星的检测限均为30ng/g,整个检测过程(包括样品前处理)可在20 min内完成。吴茂生等利用胶体金免疫层析法对水产品中呋喃妥因代谢物残留进行检测,检测限为1.0μg/kg,假阳性率低于5%,假阴性率为0,且通过液质联用法确证,两者结果一致。张敏等研制出一种快速检测水产品中磺胺类药物的胶体金免疫试纸条,该试纸条对水产品中的磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶的检出限分别是5μg/kg、40μg/kg、45μg/kg和100μg/kg,与四环素、盐酸克伦特罗、环丙沙星、氯霉素等无交叉反应,说明检测试剂的灵敏度和特异性都较高。檀尊社等建立了一种用于快速检测水产样品中四环素类药物残留量的胶体金免疫层析法,最低检测限可达100ng/mL,检测仅需5~10min,且与沙丁醇胺等其他兽药之间无交叉反应。
    胶体金免疫层析法是目前快检市场上炙手可热的检测手段,其借助检测试纸作为载体,操作简便,检测时间大大缩短,在水产品兽药残留方面有极大的应用,而以此为基础的大量研究也在进行中。
化学发光免疫分析法
    化学发光免疫分析法是Halman根据放射免疫分析的基本原理将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合的一种方法。其操作流程是将发光物质或酶标记在抗原或抗体上,免疫反应结束后,加入氧化剂或酶底物而发光,通过测量发光强度,根据标准曲线测定待测物的浓度。
    高彬文等建立了一种检测鱼和虾肌肉中氯霉素残留的化学发光酶联免疫法,检测限为5.8×10-4μg/kg,与传统的酶联免疫法相比其更加灵敏。刘邓等研制出一种基于鲁米诺-辣根过氧化物酶体系的化学发光免疫分析试剂盒,用于检测食品中痕量恩诺沙星残留,检测线性范围为0.024~2.76ng/mL,其中对鱼肉和虾肉样本的添加回收率分别在92%~112%和86%~112%之间。谢体波等研究了化学发光检测试剂盒对畜禽及水产品中呋喃唑酮代谢物残留的检测效果,发现试剂盒对猪肉、鸡肉、鱼肉、虾肉4种样品的最低检测限分别为0.097μg/kg、0.098μg/kg、0.097μg/kg、0.091μg/kg,灵敏度很高,且检测只需要10min。
    化学发光免疫分析法的推广应用速度非常快,在快速检测方面拥有巨大的潜力,同时化学发光检测技术与其他技术联用的研究也在不断进行,有望催生出更好的食品安全检测方法。
量子点荧光免疫分析法
    1998年,Chan等发现在牛血清白蛋白中,多克隆抗体能够识别量子点标记的免疫球蛋白,使量子点聚集在一起。由此,量子点开始应用于荧光免疫分析中,其基本原理就是将量子点作为示踪标记物应用于免疫层析法中。
Sai等建立了基于小分子半抗原直接包被方式和量子点荧光探针结合的新型荧光免疫分析方法,并将其用于检测虾仁中的氯霉素。该法的灵敏度为30.2ng/mL,最低检出限为1.2ng/mL,与传统的酶联免疫法相比,灵敏度提高约5倍,检测时间缩短了1h。田玮研究了用于检测鱼中氯霉素残留的量子点荧光免疫分析法,其灵敏度高且检测时间短。居莹制备出具有免疫活性的量子点荧光探针,并组装成孔雀石绿量子点免疫试纸条,其检测限为1.5μg/kg。张蕾应用CdTe量子点研制出呋喃唑酮快速荧光免疫层析试纸条,检测了水产品虾肌肉组织中呋喃唑酮代谢物的残留量,检测限为10.0ng/g,假阴性率和假阳性率均小于5%,且与呋喃西林代谢物、呋喃它酮代谢物和呋喃妥因代谢物的交叉反应率均小于1%。
    量子点荧光免疫分析法是量子点在食品领域的应用,弥补了传统快检方法灵敏度不高、抗干扰能力不强的缺点,促进了食品安全快速检测技术的发展。
化学比色法
    化学比色法主要包括试纸、试剂盒等,相对于其他快速检测方法,是一种操作简单的检测手段,适用于大批量样品的检测。
    窦红建立了一种用于快速检测水产品中孔雀石绿及其代谢物的化学比色法,孔雀石绿及其代谢物的检出限分别为2μg/kg和4μg/kg。钱蓓蕾等研究出了一种用于检测孔雀石绿残留的快速检测试剂盒,检测限为1.0~10.0μg/kg。
    由于化学比色法的灵敏度较低,在水产品兽药残留快速检测方面的应用前景有限,目前不再着重于该法的研究,而是寻找更好的方法。
表面增强拉曼光谱
    1974年,Fleischman等发现吸附在粗糙银电极表面上的吡啶分子可以得到增强的拉曼信号。随后,Jeanmaire等证实了该光谱现象,表面增强拉曼光谱技术(SERS)由此产生,其基本原理是拉曼散射效应产生的分子振动光谱,该光谱反映了分子的特征结构信息。
    顾振华等研究了使用便携式拉曼光谱仪对水产品水样中孔雀石绿进行快速检测的方法,检测限为5.0μg/L,常见物质对其测定无干扰,且从样品制备到结果显示一般只需要3min。Zhang等建立了一种鱼肉产品中恩诺沙星、呋喃唑酮和孔雀石绿的SERS分析方法,可以检出罗非鱼鱼片中1.0μg/g的呋喃唑酮和200ng/g的孔雀石绿。随后,该研究小组又利用SERS检测鱼肉中的孔雀石绿和结晶紫,检测最低浓度分别为1.0μg/kg和2.0μg/kg。Fu等也建立了一种水产品中孔雀石绿的SERS分析方法,其线性范围为2.5~100μmol/L,检测限为2.5μmol/L。钟坚海等将表面增强拉曼光谱与分子印迹和磁性纳米技术相结合,实现了对养殖水和虾肉中孔雀石绿的高效富集,检测限分别为0.5ng/mL和6ng/g。
    除了对孔雀石绿检测的研究,表面增强拉曼光谱在抗生素检测方面也有应用。赖克强等对磺胺类抗生素进行了SERS探测,能够检测到的最低浓度为10ppb。随后,研究小组又结合化学计量法快速检测了水产品中磺胺甲基嘧啶的残留,结果表明SERS技术对磺胺甲基嘧啶标准溶液的检出限为5ng/mL,鱼肉中磺胺甲基嘧啶的检出限为20ng/mL。马海宽等以银溶胶为表面增强拉曼活性基底,检测出磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的最低限度均为1ppm,检测限分别为0.16ppm、0.59ppm,实现了鱼肉中磺胺类抗生素的痕量检测。
    表面增强拉曼光谱无损样品、可用于现场快速检测的特点使其具有广阔的应用前景,但是其选择性和数据重现性较差极大地限制了该法的推广,因此,需要进一步与其他技术相结合,进而加大对拉曼增强基底的研究。
    水产品中的兽药残留是当前社会关注的热点问题,也是人们生活中时刻关注的问题。除了从源头上进行控制,还需要可靠的快速检测技术作为支撑,保障人们的食用安全。目前,已有多家公司拥有成熟的快检商品化产品用于现场快速筛查,且进一步的研究也在持续进行。本文简要介绍了几种用于水产品兽药残留的快检方法,无论是已经较为成熟的快检方法,还是仍处于研究中的方法,都将为人们的食品安全提供一层屏障,相信未来还会有更多、更好的快检技术诞生。
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