《食品安全导刊》刊号:CN11-5478/R 国际:ISSN1674-0270

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猪组织中赛庚啶间接竞争ELISA检测方法研究

2017-12-06 16:02:19 来源:

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□ 杨玉婷 佟世生 北京城市学院生物医药学部
□ 秦誉 北京维德维康生物技术有限公司
    酶联免疫分析方法(Enzyme-Linked Immuno-So rbent Assay, ELISA)具有特异性高、灵敏度高和成本低等特点,适用于现场监控和大量样本的快速筛选。本研究在前期制备的赛庚啶人工抗原和单克隆抗体基础上,建立了对猪组织中赛庚啶残留的间接竞争ELISA检测方法,为后续检测产品研发奠定了基础。

    赛庚啶(Cyproheptadine,CLD)是一种具有抗胆碱能力和镇静作用,可用于治疗各种过敏性疾病的抗组胺药,也可用于改善患者食欲。近年来,人们发现在饲料产品中添加赛庚啶会增加动物食欲,可达到增加养殖动物体重的目的。但食用含赛庚啶残留的动物源性产品会对人体造成不利影响,浓度高时可直接引发昏厥、呼吸急促、全身无力等中毒症状,严重者则直接导致死亡。
    农业部1519号公告将赛庚啶列入《禁止在饲料和动物饮水中使用的物质》,然而饲料安全预警监测结果表明,国内仍然有一些饲料产品中添加了此类药物,同时也有在猪肉组织中检出赛庚啶残留的报道。因此,加强对赛庚啶残留的检测迫在眉睫。目前,已报道的检测方法有液相色谱法、液相色谱-串联质谱法,而且多为动物尿液及饲料中赛庚啶残留的检测。因此,建立一种直接、方便、灵敏、高效、准确的检测方法十分必要。酶联免疫分析方法具有特异性高、灵敏度高和成本低等特点,适用于现场监控和大量样本的快速筛选。本研究在前期制备的赛庚啶人工抗原和单克隆抗体基础上,建立了对猪组织中赛庚啶残留的间接竞争ELISA检测方法,为后续检测产品研发奠定了基础。
材料与方法
材料与试剂
    赛庚啶和可乐定标准品(98%中国兽医药品监察所)、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(美国Jackson)、四甲基联苯胺(华美生物工程公司)、小牛血清(杭州四季青)、牛血清白蛋白(美国SIGMA)、赛庚啶完全抗原和单克隆抗体(北京维德维康生物技术有限公司研发中心制备保存);猪肉、猪肝等样本(超市)。甲醇、二氯甲烷、碳酸钠、氯化钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、无水乙醇、乙酸乙酯、乙腈、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾均为分析纯级别(国药集团)。
仪器与设备
    MK-3酶联免疫测定仪(Thermo);QL-901涡动仪(海门其林贝尔);TDL-40B离心机(上海安亭科学仪器厂);酶标板(厦门云鹏);氮吹仪(美国organomation);移液器(Thermo);精密电子天平(梅特勒-托利多)。
方法
    1 ELISA检测条件的优化
    1.1 最适包被浓度与最适单抗浓度的优化
    将包被抗原以1:2000、1:10000、1:50000、1:250000稀释包板,每个稀释度包两条作为平行。比较各组的最大吸光度和抑制率,确定最适包被浓度。
    单抗设定1:2000、1:10000、1:50000、1:250000共4组稀释度。比较各组最大吸光度和抑制率,确定最适单抗稀释倍数。
    1.2 包被液pH的优化
    分别用3种不同pH值的包被液将赛庚啶包被原稀释至最适工作浓度。比较各组最大吸光值、灵敏度点抑制、IC50值和曲线的线性,确定最适包被液pH。
    1.3 封闭液的优化
    分别用4种不同配方的封闭液封闭,37℃温育2h,其余变量相同。比较各组最大吸光值、灵敏度点抑制、IC50值和曲线的线性,确定最适封闭液配方。
    1.4 包被条件的优化
    用包被液将赛庚啶抗原稀释至最适工作浓度,每孔100μL,分成3组。第一组:37℃温育2h;第二组:室温放置2h;第三组:4℃过夜。比较各组最大吸光值、灵敏度点抑制、IC50值和曲线的线性,确定最适包被条件。
    1.5 样品溶液与单抗溶液体积比例的优化
    加入样品溶液和单抗溶液比例分别为:30μL:70μL、40μL:60μL、50μL:50μL、60μL:40μL、70μL:30μL和80μL:20μL。比较最大吸光度和抑制率,确定最适样品与单抗体积比例。
    1.6 试剂盒特异性的确定
    选择对赛庚啶类似物可乐定(Apraclonidine)、罗米非啶(Romifidine)、替扎尼定(Tizanidine)、赛拉嗪(Xylazine)、克伦特罗(Clenbuterol)、莱克多巴胺(Ractopamine)和沙丁胺醇(Salbutamol)进行测定,得到各类似物在标准曲线各点的OD值,应用RIDAWIN软件分析,得出类似物的IC50,从而计算其交叉反应率(CR):
交叉反应率(CR)=IC50(CLD)/IC50(类似物)×100%
    1.7 试剂盒精密度的测定
    用零标准的OD值来测定ELISA方法的可重复性,分别测定板内差、批内差和批间差。
    2 样本的添加回收试验
    样本的前处理方法如下:
    猪肉:准确称取2±0.01g均质后的新鲜组织样品于50mL离心管中;加入1mL 0.1M盐酸,再加入1mL无水甲醇,室温(25±2℃)下,充分涡动3min;4000r以上,离心10min;取100μL上清液于新的离心管中,再加入400μL 0.02M PBS,涡动30s混匀,然后进行检测。
    猪肝:准确称取2±0.01g均质后的新鲜组织样品于50mL离心管中;加入0.5mL 0.1M盐酸,再加入0.5mL 1M EDTA-2Na溶液,最后加入1mL无水甲醇,室温(25±2℃)下,充分涡动3min;4000r以上,离心10min;取100μL上清液于新的离心管中,再加入400μL 0.02M PBS,涡动30s混匀,然后进行检测。
    每个添加浓度做两份样品,每份样品的提取液做两个重复。各样品经上述方法处理后,用优化的ELISA方法检测,测定OD450值,用RIDAWIN软件分析数据,得出赛庚啶的含量,并根据下式计算添加回收率。
添加回收率(%)=实测值(ng/mL)/添加值(ng/mL)×100%
结果与分析
    ELISA检测条件的优化
    1 最适包被浓度与最适单抗的优化
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    实验选择最大吸光值在2.0左右,灵敏度抑制率在80%以下为合适的抗原抗体稀释倍数。最适包被浓度与最适单抗的优化结果见表1、表2,由表可知,随着包被原浓度和抗体浓度的降低,最大吸光值也在降低,当抗原做1:50000稀释,抗体做1:10000稀释时,灵敏点抑制率为79.3%,最大吸光值和灵敏度抑制均符合要求,故确定其为最适稀释度。
    2 包被液的优化
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    结果见表3,由表3可知,比较3种缓冲液的最大吸光值、灵敏度点的抑制率、IC50及曲线线性,选择0.05mol/L、pH=9.6的碳酸盐缓冲液做为包被液。
    3 封闭液的确定
    分析较几种常用的封闭液,结果见表4。选择最大吸光值较大,IC50较低,曲线线性大于99%,灵敏度点抑制在70%~80%之间的封闭液,最终选择5%的脱脂奶粉做为封闭液。
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    4 包被条件的优化分析
    包被条件的优化见表5,实验选择最大吸光值较大,灵敏度抑制率为70%~80%,IC50在0.1ng/mL左右,线性相关系数在99%以上的数据,由表确定4℃反应16h作为试剂盒的最佳包被条件。
    5 样品溶液与单抗溶液体积比例的确定
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    结果见表6,样品溶液与单抗溶液体积比为40:60时,灵敏度抑制率在70%~80%之间,最大吸光度值在2.0左右,线性相关系数为99.45%,因此确定样品溶液与单抗溶液体积比为40:60。
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    6 特异性的测定
    结果见表7,该单抗与赛庚啶、可乐定、罗米非啶、替扎尼定、赛拉嗪、克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的交叉反应率分别为100.0%、0.1%、0.05%,其余均小于0.05%,表明对赛庚啶灵敏。
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    7 精密度的测定
    精密度通常用标准样品的批内和批间相对标准差(RSD)或者变异系数(CV)来进行考察,一般要求CV应小于10%。精密度的测定见表8,由表8可以看出3批酶标板的板内变异系数小于5%,板间变异系数小于10%,符合要求。
    样本的添加回收率检测
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    取空白样本各5份,根据检测限要求对样品进行添加,每种样本、每个浓度各做2个平行,按提取方法进行提取稀释,所得样本溶液进行ELISA检测,计算添加回收率。表9、表10表明两种组织的添加回收率均在70%~128%之间。
结语
    本研究在已制备的赛庚啶抗原和单克隆抗体的基础上,对抗原浓度、抗体浓度、包被液配方、封闭液配方、包被条件等进行了摸索和优化,研制了检测猪肉组织中赛庚啶的ELISA方法,该方法IC50变动范围在0.1~0.15ng/mL之间,猪组织中检测限为0.5μg/kg,添加回收率70.0%~128.0%之间(添加浓度为0.5μg/kg和1.0μg/kg),样本重复检测的变异系数在2.6%~12.1%之间,具有良好的特异性、准确性和重复性,表明本ELISA方法的稳定性符合检测要求,能够满足对猪组织赛庚啶检测的需要。
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