《食品安全导刊》刊号:CN11-5478/R 国际:ISSN1674-0270

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动物源性食品鸭血中鸭成分普通PCR检测方法探究

2018-03-27 12:17:52 来源: 食品安全导刊

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  摘要:研究鸭血因DNA部分降解而使普通PCR检测结果偏离的优化方法。对普通PCR方法未检出但实时荧光定量PCR方法检出的鸭血DNA通过增加扩增模板量到5uL,扩增产物稀释100倍进行二次扩增,可以得到的DNA纯度较高,凝胶电泳条带明亮,背景清晰,改进的方法能使普通PCR方法检测结果准确性提高,降低假阴性概率。
 
  关键词:鸭血,普通PCR检测,假阴性,鸭血DNA,二次扩增
 
  鸭血的营养价值很高,含有丰富的蛋白质、多种微量元素(如铁、铜、钙等),有补血和清热解毒的作用,并有预防和治疗缺铁性贫血的功效。鉴于如此的食用功效,且鸭血液量相对于体积庞大的动物血量相对较少,因此鸭血的价格明显偏高,部分商家为了盈利可能会在鸭血中掺杂猪血甚至其他动物血来销售。以DNA为基础的PCR技术广泛被用来鉴定食品中的动物源性成分[1],由于血液保质期短,在加工制作的过程中会加入盐和凝固剂[2]等化学物质,加之在提取鸭血DNA过程中的物理作用等会对DNA造成破坏,使DNA含量降低而使检测结果有偏差。
 
  目前检测鸭成分的方法有普通PCR法和实时荧光定量PCR法,国家检测鸭成分的唯一标准SN/T 3731.5-2013《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第5部分:鸭成分检测PCR法》是用普通PCR法,实时荧光定量PCR法是不同的试剂盒公司开发出来的用于科研用方法,暂无实时荧光定量PCR法检测鸭成分的国家检测标准。荧光定量PCR在灵敏度、准确度、便捷性上均高于普通PCR,但对于需要出具第三方检测报告的单位和企业,只能用国家标准进行检测,本文对SN/T 3731.5-2013检测鸭血样品中鸭成分因鸭血DNA部分降解而导致结果偏离进行了方法优化探索,以提高检测结果的准确性。
 
  材料与方法
 
  材料与试剂鸭血:购自南京某大型超市。
 
  DNA提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 5.0、TaKaRa Taq(5U/uL)、10×PCR Buffer(Mg2+plus)、dNTP Mixture(各2.5mM)、PCR体系预混液Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)宝生物工程(大连)有限公司。
 
  仪器和设备:EPS 300电泳仪Tanon;Universal GenoSens1800凝胶成像仪:上海勤翔;ABI 2720普通PCR仪:美国赛默飞;PikoREAL 96实时荧光定量PCR仪(96孔板):美国赛默飞。
 
  引物:参照标准[3]合成扩增鸭源性成分的引物,引物序列见标准[3]表1。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。
 
  DNA提取方法:鸭血DNA提取方法按照DNA提取试剂盒的方法步骤进行提取。
 
  普通PCR检测:鸭血中鸭成分检测步骤见SN/T 3731.5-2013[3]。
 
  实时荧光定量PCR检测:将鸭血所提DNA进行鸭源性成分的实时荧光定量PCR检测,PCR反应体系为:预混液20μL,包括DNA模板1.6uL,Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)10uL,上下游引物各0.4uL,Probe 0.8uL,加ddH2O补足20uL。
 
  鸭成分实时荧光定量PCR反应条件为:95℃预变性30s;PCR反应:95℃5s,60℃30s,进行40个循环。根据扩增曲线Ct值≤35视为检出鸭成分。
 
  增加模板进行扩增检测:将鸭血DNA添加不同模板量进行扩增,即PCR反应体系中DNA模板分别添加1uL、2uL、5uL、10uL,反应体系和反应条件见SN/T 3731.5-2013[3]。扩增产物进行电泳检测。
 
  二次扩增:将1.7扩增后的产物取2uL加入98uL ddH2O进行100倍稀释,取1ul作为模板进行二次扩增,反应体系和反应条件见SN/T 3731.5-2013[3]。扩增产物进行电泳检测。
 
  结果与分析
 
  鸭血样品普通PCR和实时荧光定量PCR检测结果:对提取的鸭血DNA利用鸭源性引物进行PCR扩增,反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果,结果见图1。对提取的鸭血DNA利用鸭源性引物进行实时荧光定量PCR,结果见图2。
 
  由图1可知,空白对照和阴性对照无条带产生,阳性对照在226bp有条带产生,鸭血DNA扩增后在226bp位置无可见条带,未检出鸭成分。由图2可知,实时荧光定量PCR检测结果空白对照和阴性对照均为未检出,阳性对照Ct值分别为18.26,检出鸭成分,鸭血两个平行样Ct值分别为23.21/23.95,检出鸭成分。普通PCR与实时荧光定量PCR检测结果不一致,可以推测鸭血中鸭DNA可能受物理、化学等因素的影响,核酸有降解。
 
  
  由图3可以看出,添加鸭血模板量1uL、2uL、5uL、10uL,每个模板梯度各2个平行样,扩增后都是Smear,阳性对照条带正常而且很亮,排除了反应体系及引物的原因。因为鸭血与鸭肉不同,血液的保存期短,储存不了太长时间,基因组降解可能性大。
 
  二次扩增检测结果:由图4可以看出,对鸭血DNA添加不同模板量1uL、2uL、5uL、10uL扩增后的产物,经过1.8步骤进行二次扩增后,空白对照和阴性对照无条带产生,阳性对照在226bp有条带产生,不同模板添加量1uL、2uL、5uL、10uL二次扩增的扩增产物,2uL模板添加量在226bp位置有弱条带,5uL和10uL模板添加量在226bp位置有明亮条带,无非特异性条带,扩增结果良好。
 
  通过增加模板DNA量至5uL后扩增,可以增加目的DNA的含量,通过稀释后,可以降低杂质的含量从而增加目的DNA的含量,提高扩增目的DNA的准确度。目前普通PCR法是国家现有的检测鸭成分的唯一标准方法,是需要出具正式检测报告的检验检测机构的唯一检测方法,而普通PCR法有很大的局限,检测结果不够准确,如果单以SN/T 3731.5-2013方法检测鸭源性成分,可能得到错误的检测结果,因此通过此优化方法来优化检测过程,可以提高检测结果的准确度,可为质检部门及第三方检测机构推广应用,作为实验室检测血液类食品的常规检测手段。
 
  参考文献
 
  [1]全国文献工作标准化技术委员会.SN/T 1119-2002进口动物源性饲料中牛羊源性成分检测方法-PCR方法[S].北京:中国标准出版社,2002.
 
  [2]邵碧英,杨婕,张体银.动物产品的DNA提取方法[J].畜牧与兽医,2005,37(9):47-49.
 
  [3]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.SN/T 3731.5-2013食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法-第5部分:鸭成分检测-PCR法[S].北京:中国标准出版社,2013.
 
  徐慧马慧娟
 
  作者简介:
 
  徐慧,硕士研究生,高级工程师,实验室技术负责人,江苏省理化测试中心。
 
  马慧娟,江苏省理化测试中心。
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