MALDI-TOF MS在食品微生物中的应用：数分钟内确认和鉴定微生物

□Erin Crowley Q实验室

一系列的微生物都可能对食物造成污染，如细菌、酵母菌、霉菌和寄生虫等。常见的食源性致病菌包括沙门氏菌属、克罗诺杆菌属、弯曲杆菌属，以及单核细胞增生李斯特菌等。如未能及时检测食品中的微生物含量，食源性致病菌将会通过受污染的食物进行传播扩散，进而爆发严重的疾病。通过监测大肠杆菌、李斯特菌、酵母菌和霉菌等质量指标，可对食品工艺卫生情况和质量进行评价。如今，用于识别食品中微生物的技术种类繁多，包括传统的基于培养的方法、使用聚合酶链反应(PCR)试验的分子检测方法，以及日益复杂的分析技术，如质谱法(MS)。然而，研究人员和测试制造商仍试图寻找更为先进的方法，希望以更高的准确性和灵敏度进行更快速的测试。

质谱的发展

历经多年发展，食品工业已经习惯于使用经AOAC或ISO 16140认可的快速检测方法——这些定性或定量方法被食品安全管理机构所接受，且区域法规也对其予以认可，并鼓励将它们应用于各种各样的食品。新技术的发展，如基质辅助激光解吸/电离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱或测序技术凭借其更快速、更可靠的结果被大范围应用，促使食品微生物检测技术进入新的纪元。

检测时间的长短往往是考量食品微生物实验室合格与否的关键因素之一，因此，MALDI-TOF MS快速准确地确认与鉴定微生物的能力在常规测试中具有极高价值。对比研究表明，在准确鉴定细菌和真菌方面，MALDI-TOF MS(100%)与传统鉴定板(94%~97%)存在差异——MALDI-TOF MS在速度及试剂成本方面拥有较大优势。

Q实验室(美国俄亥俄州辛辛那提市)自1966年就服务于食品、化妆品、制药、保健美容和膳食补充剂行业，可以提供全面的微生物学、化学实验室及研发服务。作为一家将先进的技术与个人服务和关注相结合的独立实验室，Q实验室致力于提供满足所有测试和质量保证需求的服务。近期，Q实验室的微生物食品实验室采用MALDI-TOF MS进行日常食品微生物测试及研发(R&D)工作。微生物鉴定实验室使用标准的“工具箱”方法，其中包括标准的台式培养法、自动生化法、镜检和16S rDNA测序法等。近年来，行业对微生物鉴定技术的内部审查及用户对先进替代方法的应用需求不断提升，促进了采用MS进行鉴定工作的推进。由于实验室承接专家鉴定机构外包业务，因此成立了技术进步小组(TAG)，专门负责审查当前使用和未来将要实施的技术。

在这一行动中，食品微生物学工作被划分为两部分，即常规测试与研发(R&D)，前者由用户提交样品以确认并鉴定食品中的微生物，后者则是对用户希望推广和销售的诊断分析方法进行验证以获得认证。

图1 从​MALDIBiotyper(MBT)获得的图谱示例

MALDI-TOF MS常规测试

2017年1月，微生物食品实验室将MALDI-TOF MS添加到其用于常规微生物鉴定与研发的工具箱中。该技术能够获得微生物的特征蛋白质指纹图谱，并将指纹图谱与覆盖面广泛的数据库中的数千个参考图谱相匹配，从而准确可靠地鉴定特定目标微生物。此外，利用现有技术可对该工具箱进行补充，例如，使用rDNA测序方法鉴定微生物序列。

MALDI-TOF MS技术使实验室能够拥有灵活的周转时间(TAT)和成本选项，以适应用户的检测需求。这样一来，实验室就能进行完全定制化的服务，如鉴于菌种快速鉴定的需要——有些工作需要当天完成，MS技术可做到这一点，而传统方法则无法实现。MALDI-TOF系统检测结果更高的准确性及更灵敏度意味着重复测试次数更少，因此在第一次得到鉴定结果时，用户可当即作出判定。

在发生病原菌污染的情况下，传统的生化测试方法需要3~7天才能确定病原菌的种类与数量。如病原菌检测结果预判为阳性，那么如何缩短确认结果所需的时间将变得十分关键，MALDI-TOF MS可有效避免产品召回的延误，并延缓感染性微生物的爆发。该技术可在30分钟至2小时完成样品分析，用于确认某种替代方法的疑似结果，或从平板上直接鉴定微生物。

验证新的分析方法

常规实验室测试样品来自食品，而研发实验室测试的“样品”则是技术本身。技术公司及诊断合作伙伴将新的技术或分析方法带到Q实验室进行方法验证，包括沙门氏菌、李斯特菌或军团菌的检测等，并要求对其工作提出建议。Q实验室的用户和方法验证组织(如美国的AOAC INTERNATIONAL)制定了一种研究设计，其满足AOAC附录J指南要求——MicroVal和AFNOR认证是欧洲的认证机构，采用的方法按ISO 16140标准进行评估;“专家实验室”(Q实验室)与技术提供商合作制定方法、并将其提交到认证机构以供技术审核员批准。Q实验室是北美唯一被AOAC、MicroVal和AFNOR这3个主要认证机构认可的专家实验室，这使AOAC/ISO联合验证研究的设计，以及满足所有用户需求成为可能。

协作研究

在AOAC-OMA研究或ISO 16140验证研究中，需要选取一个领先的内部实验室(如微生物研发实验室)进行对比协作研究，即对技术的重现性进行测验，这就需要在全世界招募12~15个实验室同意自愿对收到的盲样进行测试。在这一项目中，所有实验室需在同一天使用相同的技术对样品进行评估，分析完成后，各实验室将数据提交给主导实验室进行统计分析，然后为用户生成一份完整报告，并提交给认证机构。最后，由技术委员会进行审查并在协商一致后批准，此项批准意味着该方法适用于预定目的并满足验证要求。

Q实验室对Bruker的MALDI Biotyper(MBT)进行了AOAC-OMA和ISO 16140的验证，并通过结合现行指南(AOAC附录J指南与新的ISO 16140第6部分标准)创建了一个优化研究设计以验证MBT在食品微生物分析中的应用。由于对确认与鉴定方法设计的验证尚未能够跟上最新的技术发展，这一研究成为该领域的首个相关研究应用。表1给出了提交AOAC-OMA和ISO 16140批准的MBT合作研究的设计及结果汇总。

Q实验室于2017年12月获取了MBT的AOAC-OMA研究结果，成为两项独立研究的主导实验室——第一种是确认与鉴定沙门氏菌、克罗诺杆菌和其它革兰氏阴性细菌;第二种为确认与鉴定食品微生物中的单核细胞增生李斯特菌、李斯特菌属和其它革兰氏阳性细菌。作为MicroVal批准的ISO 16140专家实验室，Q实验室在2018年初组织了首次研究，并获得4项证书;2018年4月，其在斯德哥尔摩举行的食品保护内部协会(IAFP)活动上，分别以海报和研讨会的形式，与MicroVal技术委员会成员共同发布了该结果。

因持有AOAC官方分析方法，以及ISO验证/MicroVal认证级别的认证，MALDI-TOF MS方法被食品药品监督管理局(FDA)接受并用于病原菌的确认，符合欧洲法规EC 2073/2005。并且，FDA和欧洲法规都要求第三方认证机构批准验证数据，并将其视为与其现有确认/鉴定方法(被视为金标准)具有同等效力的替代方法。

微生物确认与鉴定的未来

一直以来，质谱法都是一种分析化学工具，其最近通过了AOAC-OMA和ISO 16140认证，这证明了在微生物学家掌握下的MBT具有可靠性、稳定性和重现性。因此，将MALDI-TOF MS应用到常规测试工作流程中可实现重大的资源整合，并将取代多种传统的生化鉴定方法，进而消除DNA测序中的大量步骤、及工作站计量要求带来的负担。在分析前，检测人员无需知晓目标微生物的类型，因为细菌、酵母菌或霉菌都将按照相同的工作流程同时进行分析。

由于用户对食品和环境污染物的鉴定需求不断上升，Q实验室正在扩大其通过MALDI-TOF MS和rDNA测序提供的确认与鉴定服务，并寻求增加其环境测试服务。对于一个分离的菌落，可在15分钟内获得确认/鉴定结果，而对于一整块MALDI靶板样品如95个样品，仅需不到1小时即可获得结果。当时间对决策者至关重要时，拥有此技术可提高危机应对能力。