《食品安全导刊》刊号:CN11-5478/R 国际:ISSN1674-0270

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LC-MS/MS法同时快速检测牛肉中12种β-受体激动剂的应用研究

2020-09-25 12:22:31 来源: 食品安全导刊

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  LC-MS/MS法同时快速检测牛肉中12种β-受体激动剂的应用研究
  
  β-受体激动剂,俗称瘦肉精,不是某一种特定的药物,而是一类药物,能够促进瘦肉生长、抑制肥肉生长。当它们以超过治疗剂量5-10倍的用量用于家畜饲养时,即有显著的营养“再分配效应”,促进动物体蛋白质沉积、促进脂肪分解抑制脂肪沉积,能显著提高胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率,因此曾被用作牛、羊、禽、猪等畜禽的促生长剂、饲料添加剂。[1-3]
  
  但瘦肉精用量大、作用的时间长、代谢慢,所以在屠宰前到上市,在动物体内的残留量都很大。这个残留量通过食物进入人体,就使人体渐渐地中毒,如果一次摄入量过大,就会出现异常的生理反应,因此而被禁用。人若食用含瘦肉精的肉类后会出现头晕、恶心、手脚颤抖、心跳加速甚至心脏骤停致昏迷死亡,特别对心律失常、高血压、青光眼、糖尿病和甲状腺机能亢进等患者有极大危害。[4-7]
  
  在中国,通常所说的“瘦肉精”则是指盐酸克伦特罗。它曾经作为药物用于治疗支气管哮喘,后由于其副作用太大而遭禁用。其它类似药物还有沙丁胺醇和特布他林等,都因为对人体健康危害过大,造成安全隐患,而在全球遭到禁用。在2001年12月27日、2002年2月9日、4月9日,农业部分别下发文件禁止食品动物使用β-受体激动剂类药物作为饲料添加剂(农业部176号、193号公告、1519号条例)[8-12]。
  
  因为能够促进瘦肉生长、抑制动物脂肪生长,瘦肉精让猪、牛、羊等牲畜的瘦肉率提高,带来更多经济价值,国内养殖户不顾农业部的规定,在饲料中掺入过量瘦肉精,给市场上的肉类食品带来了严重的安全隐患,所以研究出科学、高效、快速、准确的检测方法十分必要。
  
  目前常用的β-受体激动剂检测方法有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱质谱联用法(GC/MS)、酶联免疫法(ELISA)和液相色谱串联质谱法(LC/MS/MS)。其中HPLC法灵敏度较低,不能满足痕量检测要求[13-15];GC/MS法除了需要大量的前处理步骤,还要求进行衍生化操作,较为繁琐;ELISA法虽然操作简单,但极容易出现假阳性情况,定性结果的准确性较差;只有LC/MS/MS法具有高效的分离能力和准确的定性定量能力,被广泛使用,但此法也因为复杂耗时的前处理而被诟病[16]。因此建立一种科学、高效、快速、准确的检测方法十分必要。
  
  材料与方法
  
  仪器与试剂
  
  仪器名称:NexeraX2超高效液相色谱和8045电喷雾三重四级杆质谱仪(日本岛津)、ULPHW-I超纯水机(上海优普)、MTN-2800W氮吹浓缩仪(德国AUTO Science公司)、超声波清洗机(昆山洁力美)、H1850R冷冻离心机(湘仪仪器)、TG16-WS高速离心机(湘仪仪器)、VM-D涡旋混合器(上海皓庄仪器)、JY2002百分之一电子天平(舜守恒平仪器)、肉类绞碎机(嘉厨食品机械)、ATX224万分之一电子天平(日本岛津);仪器经校准检定合格后方可使用。
  
  标准溶液名称:实验所用β-受体激动剂类标准品:盐酸克伦特罗(Clenbuterol)、莱克多巴胺 ( Racto pamine)、沙丁胺醇(Salbutamol)、特布他林(Terbutaline)、西马特罗(Cimaterol)、氯丙那林(Clorprenaline)、溴布特罗(Brombuterol)、齐帕特罗 (Zilpaterol)、喷布特罗(Penbutolol)、马布特罗(Mabuterol)、妥布特罗(Tulobuterol)、非诺特罗(Fenoterol)采购于曼哈格公司。
  
  同位素内标克伦特罗-D9 (Clenbuterol-D9)、莱克多巴胺-D3 (Ractopamine-D3)、沙丁胺醇-D3(Salbutero1-D3),购于Dr .Ehrenstorfer公司。
  
  实验试剂与耗材:乙腈(上海安谱公司,色谱纯)、甲醇(上海安谱,色谱纯)、乙酸(山东西亚,色谱纯)、甲酸(山东西亚,色谱纯)、无水硫酸镁(国药集团,分析纯)、无水硫酸钠(国药集团,分析纯)、乙酸铵(国药集团,分析纯)、乙二胺四乙酸二钠(国药集团,分析纯)、C18填料(天津博纳艾杰尔), 粒径40-60μm、PSA填料(天津博纳艾杰尔), 粒径40-60μm、GCB填料(天津博纳艾杰尔),粒径40-60μm;
  
  方法
  
  实验色谱和质谱条件
  
  色谱条件为:色谱柱: C18色谱柱, 规格2.1×100mm,粒径1.9μm;柱温:32℃;进样体积:2μL;流速:0.3mL/min;流动相A是体积浓度为0.1%甲酸水溶液,流动相B为0.1%甲酸水溶液[17],洗脱梯度,洗脱条件见表1;所述初始流动相是体积比为9:1的0.1%甲酸水溶液和乙腈的混合液;
  
  质谱条件为:雾化气流速:3.0L/min;干燥气流速:10.0L/min;加热气流速:10.0L/min;DL管温度250℃[18];加热气温度:350℃;接口电压:4000V;离子源类型:电喷正离子模式;扫描方式:多反应监测扫描;氦气作为碰撞气,雾化气和加热气均为氮气,干燥气为洁净空气,各个物质及内标物的主要质谱参数见表2:
  
  标准溶液的制备
  
  混合标准工作溶液:分别称取10mg的盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林、西马特罗、氯丙那林、溴布特罗、齐帕特罗、喷布特罗、马布特罗、妥布特罗、非诺特罗12种β-受体激动剂,用甲醇溶解并定容至100mL,此贮备液浓度为100mg/L,得到混合标准贮备液,用0.1%甲酸水-乙腈(9:1)来稀释混合标准贮备液,配制混合标准工作溶液,浓度梯度为0.1ng/mL,0.2ng/mL,0.5ng/mL,1.0ng/mL,2.0ng/mL,5.0ng/mL,10.0ng/mL,且每个浓度梯度中均加入有6ng的同位素内标物, 同位素内标物由质量比为1:1:1的克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D3和沙丁胺醇-D3组成。
  
  混合内标标准工作溶液:分别称取10mg的克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D3和沙丁胺醇-D3三种β-受体激动剂内标物质,用甲醇溶解并定容至100mL,此贮备液浓度为100mg/L,得到混合内标标准贮备液,用0.1%甲酸水溶液稀释混合内标标准贮备液,配制混合内标标准工作溶液,使其浓度都相当于50ng/mL。
  
  混合标准贮备液和混合内标标准贮备液需保存在-20℃冰箱中冷冻,有效期一年;混合标准工作溶液和混合内标标准工作溶液需保存在4℃冰箱中冷藏,有效期一周。
  
  混合提取剂的制备
  
  混合提取剂是体积比为2:1:9的0.25mol/L乙酸铵水溶液、0.1mol/L乙二胺四乙酸二钠水溶液和1.5%甲酸乙腈溶液的混合液;所述0.25mol/L乙酸铵水溶液用乙酸调节pH值为5.2[19]。
  
  混合除水试剂的制备
  
  混合除水试剂由质量比为3:1的无水硫酸镁和无水硫酸钠组成。
  
  混合净化试剂的制备
  
  混合净化试剂由500mg无水硫酸镁,75mg N-丙基乙二胺,100mg十八烷基键合硅胶,25mg石墨化碳黑组成[20]。
  
  样品溶液的制备
  
  购买牛肉实验样品8份(每份不少于500g),对市面上购买的实验样品(不少于500g)进行绞碎处理,并充分混匀样品,称取5.0g绞碎后的牛肉样品,向猪肉样品加入120μL混合内标标准工作溶液和12mL混合提取剂,旋涡混匀1min,超声处理20min后,加入4.0g混合除水试剂,混匀,10000rpm离心3min,得到提取液;量取3mL提取液于离心管,加入混合净化试剂,漩涡震荡30s,5000rpm离心1min后,40℃水浴氮气吹至近干后,用1mL初始流动相定容,经0.22μm滤膜过滤,得到样品溶液。
  
  上机检测
  
  用液相色谱串联质谱仪检测样品溶液和混合标准工作溶液,并以β-受体激动剂的质量浓度为横坐标,以β-受体激动剂的峰面积为纵坐标,进行线性回归,计算牛肉中β-受体激动剂的含量。
  
  结果分析
  
  标准溶液曲线图
  
  12种混合合标准工作溶液的图谱见图1;
  
  1沙丁胺醇、2特布他林、3西马特罗、4莱克多巴胺、5盐酸克伦特罗、6氯丙那林、7溴布特罗、8齐帕特罗、9喷布特罗、10马布特罗、11妥布特罗、12非诺特罗
  
  控制各个化合物质量浓度梯度为0.1ng/mL,0.2ng/mL,0.5ng/mL,1.0ng/mL,2.0ng/mL,5.0ng/mL,10.0ng/mL,以各个标准工作溶液的质量浓度X为横坐标,以其标准品的峰面积Y为纵坐标,绘制标准工作曲线。同时要控制待测样品的质量浓度在标准工作曲线的范围内。分析实验数据后得到12种化合物的线性方程,相关系数,保留时间,和检测低限见表3:
  
  8份牛肉实验样品检测结果见表4:
  
  经实验分析,在不同市场上购买的新鲜牛肉均未检出此方法中讲述的12种β-受体激动剂。
  
  选取空白基质样品,使用上述前处理方法,仪器分析方法以及耗材和仪器对其进行了添加回收实验,添加量分别为0.5ng/mL,2.5ng/mL,7.5ng/mL,色谱图峰型良好,保留时间较稳定,能够满足检测需求,实验结果见下表5:
  
  表5可以看出,本方法的添加回收率为85.37%-97.78%,RSD≤11.6%,表明本方法可以保证检测结果的准确度和可重复性,可达到检测要求,满足猪肉中β-受体激动剂的检测。
  
  结果与讨论
  
  本实验建立一种同时快速检测牛肉中12种β-受体激动剂的LC-MS/MS法。本方法中12种β-受体激动剂在质量浓度为0.1ng/mL~10.0ng/mL范围内线性关系良好(R2≥99.85),添加回收率为85.37%-97.78%,RSD≤11.6%。本方法检测准确度高、定性准确快捷、无需对样品衍生化处理、前处理时间短、减少基质干扰、检测时间短、同时减少有毒试剂的使用,值得推广使用。
  
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  项目基金:基金项目:安徽省科技重大专项(农业领域)基金项目(18030701203)。
  
  作者简介:张洋,男,工程师,研究方向为食品检测
  
  张洋
  
  安徽国科检测科技有限公司,安徽合肥,230001

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