《食品安全导刊》刊号:CN11-5478/R 国际:ISSN1674-0270

登陆 | 注册 | 设为首页 | 加入收藏

基于核酸适配体-金纳米粒子比色

2018-04-01 16:51:19 来源:

评论0  我来说两句
基于核酸适配体-金纳米粒子比色
传感器快速检测食品中赭曲霉毒素A
□ 曾宪冬 曾灼祥 陈兴会 深圳市南山区疾病预防控制中心
 
摘 要:本研究以核酸适配体为识别元件实现对赭曲霉毒素A(OTA)的高选择性识别,以及采用金纳米粒子做为比色探针,建立了适用于OTA快速检测的比色适配体传感器。研究结果表明,该比色传感器对OTA具有较高的灵敏度和特异性,操作简单快速,能用于实际食品样品中OTA的快速筛查检测;该比色传感器在520nm和650nm下吸光度的比值(A520/A650)与OTA浓度在0.05~5μM的范围内呈线性相关,检测限为0.02μM。
关键词:核酸适配体   金纳米粒子   比色传感器   赭曲霉毒素A

前言
    赭曲霉毒素是由多种曲霉和青霉菌产生的一类化合物,包括赭曲霉毒素A、B、C、D,4种结构类似的化合物,其中毒性最大、与人类健康关系最密切、对农作物的污染最重、分布最广的是赭曲霉毒素A(OTA)[1]。OTA以污染粮谷类农作物为主,但相继有报道指出,许多其他种类的食品中也检测出了OTA,如水果、葡萄酒、啤酒、咖啡、可可和巧克力、中草药、调味料等多种植物产品和食品。由于生物蓄积作用,如许多动物性食品尤其是肾脏、肝脏、肌肉、血液,以及乳和乳制品中常有OTA检出[2]
    OTA在食品中的含量通常较低,但较低含量时就可危害人体健康,因此建立一种具有一定灵敏度与专一性,且简便实用,便于推广的OTA快速检测方法具有重要意义。目前应用最广泛的OTA检测方法是高效液相色谱法(HPLC)及高效液相色谱质谱联用法[3],但这些方法存在着前处理复杂,样品提取繁琐、净化过程及检测周期长、仪器昂贵、检测成本高等缺点,而无法用于大量样本的快速筛查。
    核酸适配体是新近发展起来的一类由指数富集配基系统进化技术(SELEX)筛选产生的单链DNA或RNA片段,能特异性地结合小分子蛋白质、多肽、有机物、金属离子等各种配体,其作为识别分子在医疗诊断、环境检测、基础分析等多种技术中得到了广泛应用。金纳米粒子具有独特的光学特性,小粒径金纳米粒子(10~100nm)水溶胶一般呈红色,当金纳米粒子由于外在的作用发生聚集时,其吸收峰将变宽并发生红移,其颜色也由红色变为蓝紫色。依据这一现象,将以核酸适配体为识别元件与以金纳米粒子为比色探针相结合,构建的适配体比色探针广泛地用于各种生化检测,检测目标包括生物大分子、癌细胞、金属离子以及有机小分子[4]
    本研究开发了一种“双链复合物”模式的比色探针,通过核酸适配体将金纳米粒子连接在一起发生团聚,随着OTA与核酸适配体的结合,DNA链发生解链,连接在一起的金纳米粒子由于静电作用重新分散于溶液中,溶液颜色相应发生改变,从而实现食品中OTA的快速灵敏检测。
1 实验部分
1.1 仪器和试剂
    UV-2450紫外可见分光光度计(日本岛津公司);XS105DU型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司);Milli-Q纯水机(美国Millipore公司)。
    氯金酸(HAuCl4)为分析级,购自于美国Sigma公司;赭曲霉毒素A购自于美国Romer公司;甲醇(HPLC级,德国Merck公司);其余试剂均为分析纯,实验用水是超纯水(>18 MQ)。
    包含核酸适体的DNA寡聚核苷酸(连接链)和两条与之部分互补的DNA寡聚核苷酸(分别在3'端和5'端进行巯基修饰)均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其序列如下:
连接链(粗斜体为OTA适配体部分):5'-ACTCATCTGTGAAGA GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA -3';5'端巯基化DNA:5'-HS-CACCCGATCTCT-3';3'端巯基化DNA:5'-TCACAGATGAGTA10-SH-3';使用前3种DNA链分别用水溶解,配制成100μM的溶液。
 
1.2 金纳米粒子的制备
    利用柠檬酸钠还原法合成实验用的金纳米粒子。具体方法如下:将100mL新鲜配制的1mM的HAuCl4溶液加入到锥形瓶中,于恒温电磁搅拌器上加热沸腾2min,然后迅速加入2mL质量分数为5%的柠檬酸钠溶液,继续搅拌,加热保持沸腾10min,使溶液的颜色由淡黄色变为酒红色,停止加热,搅拌使其冷却至室温,然后将制备的纳米金溶液装入棕色试剂瓶中,置于4℃冰箱中保存备用。
 
1.3 核酸适配体-金纳米粒子探针的制备
    取5'端巯基化DNA以及3'端巯基化DNA的溶液各100μL加入10mL纳米金溶液中,搅拌均匀后,在室温下放置12h,使DNA链通过Au-S键结合到纳米金表面,再加入100μL的包含核酸适配体连接链溶液,混合均匀后,将溶液加热至94℃ 2min,快速冷却至30℃,保持30min,使包含核酸适配体连接链与纳米金表面结合的DNA杂交。然后在16000rpm下离心15min,以去除多余的、没有和纳米金结合的DNA链,加水清洗后再次离心,将制备的核酸适配体-金纳米粒子探针用10mL浓度为20mM pH=8.5的磷酸盐缓冲溶液(PBS)分散,4℃冰箱保存备用。
 
1.3 核酸适配体-金纳米粒子比色探针对OTA的检测
    OTA标准溶液:用甲醇将OTA溶解配制成1mM的标准储备溶液,临用前用PBS稀释成不同浓度的测试液。
    实际样品中OTA的提取:将不含OTA的玉米样品彻底粉碎后,加入不同浓度的OTA样品,充分混匀。称取5g加标样品,加入20mL 80%的甲醇水溶液作为提取液,涡旋混匀后震荡提取30min,离心后将上清液用氮气吹干,加入200μL甲醇溶解后,加PBS缓冲溶液稀释至1mL,通过0.45μm的微孔滤膜过滤后作为测试液。
    OTA测定:将500μL核酸适配体-金纳米粒子探针加入测试管中,再加入500μL待测液,用振荡器混匀,静置反应15min分钟,即可用肉眼观察颜色变化,实现对OTA的快速定性检测,用紫外可见分光光度计扫描反应后的溶液,利用加入OTA后吸光度的变化,实现对OTA的快速定量检测。
2 结果与讨论
2.1 检测原理
    本研究制备的“双链复合物”模式的比色探针的基本原理如图1所示:
\
    通过两条末端巯基化且与OTA核酸适配体部分互补的DNA链对金纳米粒子进行功能化处理,OTA核酸适配体链作为连接链,与两条部分互补链杂交,使功能化的金纳米粒子发生聚集,当溶液中加入OTA时,OTA与核酸适配体的结合,使其DNA构象发生改变,从而造成适配体链与互补的DNA链发生解链,团聚的金纳米粒子由于静电作用重新分散于溶液中,颜色由蓝紫色变成红色。基于这一原理,可以构建一种比色法来快速灵敏地检测食品中赭曲霉毒素A。
    利用投射电子显微镜(TEM)对核酸适配体-金纳米粒子探针加入OTA前后的微观形态进行表征,从图1可以看出,通过DNA双链的形成,在探针溶液中金纳米颗粒形成团聚物,加入OTA后,由于核酸适配体链与OTA的结合,DNA双链结构被破坏,团聚的金纳米粒子由于静电作用在溶液中变回分散态。
 \
2.2 目测比色法快速检测OTA
    利用核酸适配体-纳米粒子探针溶液的颜色变化,可以对样品中的OTA毒素进行快速检测。如图2所示,在核酸适配体-金纳米粒子探针溶液溶液中,团聚的金纳米粒子使溶液呈蓝色,加入0.5μM的OTA后,溶液变成紫红色,随着加入OTA浓度的升高,溶液逐渐变成酒红色,根据颜色变化,可以实现对OTA的定性及半定量检测。而在探针溶液中加入较高浓度(10μM)的赭曲霉毒素B(OTB)后,溶液颜色仍然为蓝色,这一结果说明核酸适配体-纳米粒子探针对于OTA具有良好的特异性。
 \
2.3 定量检测OTA
    核酸适配体-纳米粒子探针溶液对OTA响应过程的颜色变化可以通过分光光度计来测定。金纳米粒子的团聚使核酸适配体-纳米粒子探针溶液在650nm左右有较宽的吸收峰,随着OTA与核酸适配体的结合,金纳米颗粒重新分散在溶液中,其吸收光谱在520nm处出现一个特征吸收峰,随着OTA浓度的升高,650nm下的吸光度(A650)不断降低,而520nm下的吸光度(A520)不断增大,两个波长下的吸光度比值A520/A650与OTA的浓度在0.05~5μM的范围内,呈线性相关,线性相关系数为0.996。以空白溶液的3倍标准偏差计,OTA的检出限为0.02μM。对于加标浓度分别为5、10、50μg/kg的玉米粉进行加标测定,回收率在75%~102%之间,相对标准偏差在3.8%~9.6%之间。
3 结论
    本研究基于核酸适配体作为生物识别元件,金纳米粒子作为比色探针,建立了一种适用于OTA检测的比色适配体传感器,本实验方法操作简单,灵敏度高,特异性强,根据溶液颜色变化,肉眼观察即可对样品中OTA进行灵敏检出,通过分光光度计对溶液吸收光谱的变化可以对OTA进行准确地定量检测,实际样品分析检测表明该方法可用于食品中快速筛查检测。
参考文献:
    [1] 疏秀林,施庆珊,欧阳友生.赭曲霉毒素的产生及鉴别[J].中国卫生检验杂志,2008,10:2183-2185.
    [2] 李凤琴,计融.赭曲霉毒素A与人类健康关系研究进展卫生研究[J].2003,32(2):172-175.
    [3] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.GB5009.96-2016.食品安全国家标准 食品中赭曲霉毒素A的测定.2016.
    [4] Song S, Wang L, Li J, Zhao J, Fan C. Aptamer-based biosensors[J]. Trends in Analytical Chemistry. 2008, 27: 108-117.
微信关注

相关热词搜索:比色 核酸 粒子

[责任编辑:]

相关阅读

参与评论

食安中国 Copyright © www.cnfoodsafety.com 2012-2018

京ICP备09075303号-1 海淀分局网络备案编号:1101085079,1101055372

地址:北京市海淀区西四环中路39号万地名苑1号楼1004室(邮编100039)

联系电话:010-88825653   010-88825683  010-64972251   010-88825687   业务咨询:010-88825689   值班电话:18600563206